內蒙古河套灌區不同鹽堿程度的土壤細菌群落多樣性

李 新,焦 燕,代 鋼,楊銘德,溫慧洋 (內蒙古師范大學化學與環境科學學院,內蒙古 呼和浩特 010022)

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內蒙古河套灌區不同鹽堿程度的土壤細菌群落多樣性

李 新,焦 燕*,代 鋼,楊銘德,溫慧洋 (內蒙古師范大學化學與環境科學學院,內蒙古 呼和浩特 010022)

摘要：采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術對內蒙古河套灌區三種不同鹽堿程度土壤(鹽土,強度鹽化土,輕度鹽化土)不同深度(0～20cm和20～30cm)土壤細菌16S rDNA V3～V6 可變區擴增片段進行分析,并對土壤理化性質進行了測定.結果表明:細菌群落多樣性隨土壤鹽堿化程度的加深而減少(輕度鹽化土>強度鹽化土>鹽土),隨土壤深度的增加而降低(細菌群落多樣性0～20cm土層大于20～30cm土層).細菌Shannon-Wiener指數在輕度鹽化土中最大為3.36,在強度鹽化土和鹽土分別為3.05和2.49.不同鹽堿程度土壤以細菌相似系數聚類,分為0～20cm層與20～30cm層兩大族群,土壤細菌群落Shannon-Wiener指數在0～20cm層中(鹽土為3.04,強度鹽化土為3.29,輕度鹽化土為3.36)均大于在20～30cm層(鹽土為2.49,強度鹽化土為3.05,輕度鹽化土為3.14).相關性分析和典范對應分析表明,土壤w(EC)、pH值、w(SOC)、w(TP)是土壤細菌群落結構多樣性的顯著影響因素,不同鹽堿程度土壤中細菌群落的Shannon-Wiener指數與土壤w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05)呈顯著負相關,與土壤w(SOC)(r=0.700,P<0.01)和w(TP)(r=0.805,P<0.01)呈極顯著正相關.w(EC)和pH對鹽堿土壤細菌群落結構的影響力最大.回收DGGE圖譜中20個優勢條帶進行測序分析,結果顯示,變形菌綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群.

關鍵詞：河套灌區；鹽堿土壤；細菌；變性梯度凝膠電泳(DGGE)；主成分分析

* 責任作者, 教授, jiaoyan@imnu.edu.cn

土壤微生物是土壤有機組分和生態系統中最活躍的部分,在促進土壤質量和植物健康方面發揮著重要的作用,被認為是最敏感的土壤質量生物學指標[1].土壤微生物多樣性指土壤生態系統中所有的微生物種類、它們擁有的基因以及這些微生物與環境之間相互作用的多樣化程度.一般認為,土壤微生物多樣性存在于基因、物種、種群以及群落等4個層面,是土壤生態系統的一個基本生命特征,也是時間和空間的函數[2-3].國內外對農田、森林、草原的土壤微生物研究較多[4?5],但對鹽堿土壤的研究多局限于理化特性的測定分析,國內針對鹽堿土壤的微生物研究也僅限于天津濱海區域,江蘇濱海鹽堿地,松嫩平原,新疆、甘肅[6]等地,康貽軍等[7]研究灘涂鹽堿土壤微生物生態特征,曹國棟等[8]對扇緣帶鹽堿土上生長的三種植被類型下的土壤微生物類群數量進行了研究.張廣志等[9]在鹽堿土壤鑒定出假單胞菌屬和黃桿菌屬.牛世全等[10]對河西走廊鹽堿土細菌種群多樣性的16S rDNA研究表明,γ-變形菌為優勢菌群.石偉等[11]對極端鹽堿土壤細菌的分離篩選及抗鹽特性研究也發現多數菌株屬于γ-變形菌門.然而,針對內蒙古河套灌區鹽堿土壤中的微生物研究數量、種群結構、優勢菌系以及鹽害與土壤微生物活動之間的生態關系等相關報道較少.

土壤鹽堿化已嚴重制約著內蒙古河套灌區的農業生產,同時對本地區的糧食安全構成了嚴重威脅[12-13].河套灌區鹽堿地面積約4.3×105hm2,巴彥淖爾市占2.4×105hm2,其土壤鹽漬化面積與比例如下:輕度鹽化面積1.3×105hm2,占52.83%;中度鹽化面積7.6×104hm2,占31.94%;重度鹽化面積3.6×104hm2,占15.23%[14].

土壤中最活躍生物因子是土壤細菌,它既是土壤微生物的重要組成部分,占土壤微生物總數的70%～90%,也是土壤物質流和能量流的主要推動者,可以直接反映土壤肥力,已被公認為土壤生態系統變化的預警及敏感指標[15-19],在土壤養分循環中起著至關重要的作用.由于從環境樣品中分離和培養細菌困難,不經分離培養步驟,直接從土壤中提取總DNA并分析其基因信息的分子生物學方法已被發展用來描述和鑒定微生物群落.近年來基于DNA方法的群落分析如PCR擴增技術、克隆文庫法、熒光原位雜交法、限制性酶切片段長度多態性法,變性和溫度梯度凝膠電泳法[20],高通量測序技術[21]等得到了迅速的發展其中變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術由于有結果精確、可靠性強、重現率高等優點,已廣泛應用于不同生態環境中微生物群落組成、多樣性及種群動態變化的研究[22].如謝學軍等[23]借助DGGE技術研究了重金屬污染物對土壤微生物多樣性的影響;Dong等[24]利用DGGE分析方法研究了濕地土壤微生物多樣性;Smalla等[25]采用DGGE技術對不同植被根際微生物進行了微生物多樣性分析.

土壤耕作層一般疏松多孔,通透性良好,根系集中,而土壤犁底層孔隙度小,通氣性差,透水性不良.二者的差異勢必會對微生物群落結構等產生影響.該文采用DGGE技術,對內蒙古河套灌區不同鹽堿程度不同深度土壤(0～20cm耕作層和20～30cm犁底層)中細菌的群落結構和多樣性差異進行分析,探討土壤理化特性和鹽堿化土壤微生物的相互作用機制,對于鹽堿地的綜合利用與開發具有重要的實踐指導意義.

1 材料與方法

1.1 研究區概況

供試土壤采于內蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗,地處黃河北岸,河套平原東端,該地屬溫帶大陸性氣候,冬寒而長,夏熱而短,干旱少雨,春季風沙較大,極端最高氣溫為39.7℃ ,最低氣溫-30.7℃ ,年平均氣溫7.7℃ .年平均日照3212.5h,無霜期167d.降水集中于7～9月,年平均降水量213.5mm,最大降水量為8月,極端日降水量達109.6mm.

1.2 樣品采集

為避免地形等因素影響,研究樣區選擇平坦地形并按照鄰近原則布置.試驗于2014年5月未種植作物前(前茬季節作物葵花)選取3種不同鹽堿程度的鹽堿土壤,樣地S1、S2和S3(10m×10m)采用“S”型布點法采集樣方在距離地表0～20cm和20～30cm用土鉆分層取樣,每個樣方設10個樣點(1m×1m).各采樣點重復取樣3次,并將3次所得土壤樣品充分混勻,將可見的植物殘體(如根、莖和葉)和土壤動物去除,裝于無菌聚乙烯自封袋中.一份風干磨碎過2mm篩用于測定土壤理化特性,另一份迅速運回實驗室,然后將部分土樣分裝于若干無菌離心管中-80℃保存.試驗土壤樣地基本情況見表1.

表1 不同土壤鹽分含量(%)Table 1 Salt content in different types of soil in Hetao irrigation area (%)

1.3 土壤鹽堿程度分析

內蒙古河套灌區地處干旱、半干旱區,該研究三種土壤的含鹽總量依次為S1(1.69%)>S2(0.83%)> S3(0.12%),S1,S2和S3都是SO42-和Cl-含量最多,見表1,結合土壤鹽化分級標準(表2)可知,S1土壤為鹽土,S2土壤為強度鹽化土壤,S3為輕度鹽化土壤.

表2 土壤鹽化分級指標[26]Table 2 Soil salinization classification index[26]

1.4 樣品分析

1.4.1 樣品理化性質測定 pH值以1:2.5土水比用復合電極測定;電導率(EC)以1:5土水比用復合電極測定;土壤容重的測定用環刀法;土壤質地用比重計速測法;土壤有機碳(SOC)用重鉻酸鉀容量法-外加熱法;土壤全磷(TP)用HClO4-H2SO4測定,土壤全氮(TN)用凱氏定氮法.土壤鹽分:碳酸根、重碳酸根離子測定用電位滴定法;氯離子測定用硝酸銀滴定法;硫酸根離子測定用EDTA容量法;鈣、鎂離子測定用EDTA容量法;鉀、鈉離子測定用火焰光度法.理化性質具體測定方法按照《土壤農化分析(第三版)》進行[27].1.4.2 土壤總DNA的提取及細菌16S rDNA片段的PCR擴增 分別取0.5g土樣樣品,采用土壤DNA提取試劑盒(E.Z.N.A?.Soil DNA kit, Omega, USA)提取土壤總DNA.以樣品基因組DNA為模板,采用細菌通用正向引物338F在5‘末端加40個堿基的GC夾: 5c-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G ACTCCTACG GGA GGC AGC AG-3‘;和反向引物是518R:5‘-ATT ACC GCG GCT GCT GG –3’,40個GC夾加到338F前面,以保證DGGE實驗的穩定和片斷的分離,這一對引物能夠擴增絕大多數的細菌.

PCR擴增體系(50μL):10×PCR buffer 5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL;rTaq(5U/μL)0.4μL;GC-3 38F(20μmol/L)1μL;518R(20μmol/L)1μL;模板DNA 50ng;補ddH2O至50μL.PCR擴增程序:94℃預變性5min;94℃變性1min,55℃復性45s,72℃延伸1min,30個循環;最終72℃延伸10min.PCR產物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收.PCR儀為Biometra公司生產的T-gradient,凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統.

1.4.3 PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析 取10μL PCR的產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析.采用變性梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠(化學變性劑為100%尿素7mol/L和40%(V/V)的丙烯酰胺)在1×TAE緩沖液中150V 60℃下電泳5h.變性梯度凝膠電泳(DGGE)完畢后、采用銀染法染色、步驟如下:首先固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次;其次銀染液(硝酸銀1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;Milli-Q純水清洗、20s和2min各一次;再次顯色液(氫氧化鈉7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)顯色5-7min;最后用終止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)終止反應.

1.4.4 DGGE圖譜中優勢條帶的回收與測序用滅菌的手術刀切下待回收DGGE條帶,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶.以2 μL回收產物為模板,338F/518R為引物進行PCR擴增.PCR擴增體系(50 μL) 為:10×PCR buffer 5μL;dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL;338F(20mmol/L)1μL;518R(20 mmol/L)1μL;模板DNA 1μL;補ddH2O至50μL.PCR擴增程序為:94℃預變性4min;94℃變性30s,55℃復性30s,72℃延伸30s,30個循環;最后,72℃延伸10min.將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后,連接到Pmd18-T載體上,并轉化至DH5α感受態細胞中,篩選陽性克隆,進行序列測定.

1.5 數據分析方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行方差分析.細菌多樣性指數是研究群落物種數和個體數以及均勻度的綜合指標.根據電泳圖譜中樣品條帶數目及每個條帶的強度(灰度),對各樣品中細菌多樣性指數(Shannon-Wiener,H)、均勻度(Evenness, E)和豐富度(Richness,S)等指標進行分析.DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個樣品的電泳條帶數目、條帶密度進行數字化分析,多樣性指數(H)、豐富度指數(S)和均勻度指數(E)等指標被用來比較不同樣品的多樣性情況.其算法如下所示:

式中:pi為樣品中單一條帶的強度在該樣品所有條帶總強度中所占的比率;N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐富度;Ni為第i條帶的豐富度;S是某樣品中所有條帶數目總和.測序結果采用DNAstar和Cluster軟件進行序列分析,下載最相似的菌株序列作為系統發育樹的參考序列.然后采用MEGA軟件,Neighbor-joining法構建系統發育樹,自展數(bootstrap)為1000.利用Canoco for Windows 4.5軟件進行細菌群落和理化因子的典范對應(canonical correspondence analysis CCA)分析.

2 結果與分析

2.1 土壤細菌群落多樣性分析

2.1.1 土壤細菌群落DGGE圖譜 經凝膠電泳檢測,選取較高質量土壤樣品細菌基因組DNA.各樣品的PCR擴增產物經純化后進行細菌的DGGE電泳見圖1,利用Quantity One軟件對DGGE膠圖進行條帶識別和圖譜分析,結果顯示,土壤樣品微生物的16S rDNA片段通過DGGE被分離出不同位置的若干條帶.根據膠圖上條帶遷移的位置和數目可以看出細菌的種類豐富程度.樣品間的主要條帶不同,表明細菌優勢種存在差別.不同泳道同一位置條帶的明暗程度(光密度值)則反映該細菌類群在不同環境樣品中的相對豐度[28].不同土壤樣品在細菌種類組成上差別明顯.

鹽土、強度鹽化土和輕度鹽化土的表層(0～20cm)土壤中,對應的泳道有許多相同的條帶,表明這些相同的條帶所代表的細菌種群為不同程度鹽堿地群落的表層土壤所共有,但是這些共有條帶的亮度不盡相同,表示它們在各自鹽堿地群落表層土壤中的豐富度存在差異.此外,強度鹽化土和輕度鹽化土細菌群落的表層土壤有一些條帶,在鹽土中卻未見,說明強度鹽化土和輕度鹽化土表層土壤細菌群落與鹽土細菌群落有顯著差異,可能是鹽脅迫抑制了這些細菌的生長.相反,鹽土表層土壤中又有個別幾種細菌種群是其特有的,這可能與鹽土土壤中嗜鹽或耐鹽微生物有關.在20～30cm層土壤中,不同鹽堿程度土壤類型間的泳道條帶變異較大,輕度鹽化土細菌種群較鹽土和強度鹽化土少.同一鹽堿程度土壤在不同土壤深度的泳道條帶比較,可以看出各自的優勢條帶明顯,說明優勢種群發生了變化.

圖1 不同鹽堿程度不同土壤深度細菌群落DGGE圖譜Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria from different soil layers in different saline-alkaline soil

圖2 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落聚類分析Fig.2 The cluster analysis of bacterial community from different soil layers in different saline-alkaline soil數值代表各泳道與1泳道相比的相似性

2.1.2 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落相似性分析 依據樣品間的相似系數構建的聚類圖(UPGMA),如圖2所示.15個土壤樣品中,細菌群落組成總體分為兩大族群,3種類型鹽堿土0～20cm層土壤細菌聚為一族群,20～30cm層土壤細菌聚為另一族群.說明0～20cm層與20～30cm層土壤細菌種群的構成變化較大.其中,0～20cm層土壤細菌又可分成兩大族群,鹽土0～20cm層的3個重復土壤細菌聚為一族群,強度鹽化土和輕度鹽化土土壤細菌聚為另一族群.這說明鹽土的土壤細菌種群不同于強度鹽化土和輕度鹽化土的細菌種群.強度鹽化土中5#和6#的相似度為0.66,輕度鹽化土中8#和9#的相似度達0.61.一般認為相似值高于0.60的兩個群體具有較好的相似性[27].強度鹽化土和輕度鹽化土0～20cm層細菌,他們的相似系數僅為0.43,說明強度鹽化土與輕度鹽化土細菌種群結構存在很大差異.

2.1.3 土壤細菌群落多樣性指數分析 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落多樣性指數如表3所示.不論在0～20cm層還是20～30cm層土壤中,輕度鹽化土和強度鹽化土的細菌Shannon-Wiener指數和Richness均為最大,并且與鹽土有顯著性差異.說明輕度鹽化土和強度鹽化土不論在0～20cm層還是20～30cm層土壤中細菌群落都最為豐富,但其中各菌種分布的Evenness差異不顯著;隨著土壤深度的增加,Evenness不變,Shannon-Wiener指數和Richness指數均呈顯著降低.這表明從土壤0～20cm層至30cm的深度范圍內,隨著土層深度的增加,土壤細菌的Shannon-Wiener指數越小,Richness越低.

表3 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落多樣性指數分析Table 3 Analysis of bacterial genetic diversity in different soil layers in different saline-alkaline soil

2.1.4 土壤細菌群落系統組成分析 DGGE凝膠條帶回收后,以338F/518R為引物進行PCR擴增,獲得約200bp的DNA片段.PCR產物純化后連接到pMD18-T載體上,轉化至DH5α感受態細胞中,篩選陽性克隆測序.測序結果與GenBank中的序列進行比對,得到條帶所代表的細菌類型.每個回收條帶選取3個克隆進行了序列測定,如表4.根據這些DGGE帶譜所代表的微生物即可判定不同鹽堿程度土壤不同土層細菌群落的組成狀況.

條帶Band4在輕度鹽化土0～20cm條帶多,屬于固氮弓菌屬(Azoarcus)為輕度鹽化土0～20cm層特有的優勢菌.條帶Band11和Band36在鹽土0～20cm條帶多,屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)為鹽土0～20cm層特有的優勢菌.條帶Band23屬于纖維弧菌屬(Cellvibrio),條帶Band27屬于食堿菌屬(Alcanivorax),在3種不同程度鹽堿土0～20cm層都有出現.條帶Band3屬于Rhodoligotrophos appendicifer為鹽化土20～30cm特有的優勢菌.一般情況下認為,兩種細菌16S rDNA 序列同源性小于98%時屬于不同種,而同源性小于93%～95%時,則屬于不同的屬[28].所以條帶Band8、18、28、37、38和43屬于新菌的可能性比較大.

將獲得的20條序列通過BLAST比對分析后,由表5可知,大致可分為5個大的細菌系統發育類群,即變形菌門(Proteobacterium)、藍藻門(Cyanophyta)、綠彎門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)系統.其中,變形菌門的12個條帶中有7個(Band1、12、15、19、23、24和27)在3種不同鹽堿度土壤0～20cm和20～30cm都出現,屬于γ-變形菌綱(γ-proteobacteria),它是變形菌門最大的亞群,也是鹽堿土壤中的優勢類群;3個(Band3、6、34)屬于α-變形菌綱(α-Proteobacteria),1個(Band4)屬于β-變形菌綱(β-proteobacteria),1個(Band39)屬于δ-變形菌綱(δ–Deltaproteobacteria).γ-變形菌綱包括假單胞菌屬、纖維弧菌屬和食堿菌屬, α-變形菌綱包括Rhodoligotrophos appendicifer屬、新鞘脂菌屬和鞘脂單胞屬,β-變形菌綱包括固氮弓菌屬,δ-變形菌綱包括脫硫弧菌屬.藍藻門包括Crocosphaera watsonii屬,綠彎門包括Roseiflexus castenholzii,擬桿菌門包括黃桿菌屬和海藻菌屬,放線菌門包括Planobispora siamensis屬、庫茨勒菌屬和血桿菌屬.變形菌門(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群.DGGE測定鹽堿土壤中的菌株大部分都是屬于耐鹽堿的細菌菌株.

表4 測序克隆序列與其GenBank最相似序列的比對結果Table 4 Comparison between determined clone sequence and its most similar sequence in GenBank

2.2 土壤理化特性對細菌群落結構影響

2.2.1 不同鹽堿程度不同深度土壤理化特性 由表5可知, 3種不同鹽堿度不同深度的土壤, w(EC)、pH值、w(TN)、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重的含量均存在差異.同一土壤深度,3種不同鹽堿程度土壤的pH和w(EC)表現為鹽土最大,并且與輕度鹽化土和強度鹽化土有顯著差異.土壤容重、w(SOC)、w(TP)和w(TN)表現為:鹽土<強度鹽化土;同一鹽堿程度土壤,不同土壤深度,土壤水分、w(EC)、土壤w(SOC)、w(TP)和w(TN)表現為:0～20cm層含量高于20～30cm層含量,與土壤容重變化趨勢相反.pH值在0～20cm層和20～30cm層土壤中則無明顯規律.

表5 不同鹽堿程度不同深度土壤理化參數Table 5 The physical and chemical properties of different soil layers in different saline-alkaline soil

2.2.2 相關性分析 表6為0～20cm層與20～ 30cm層土壤細菌群落基因型多樣性Shannon-Wiener 指數,Evenness和Richness指數與表5七種理化參數的相關性分析結果.由表6可見,3種不同鹽堿程度土壤細菌群落的Shannon-Wiener指數與Richness都與土壤w(EC)、pH值呈顯著負相關,與土壤w(SOC)、w(TN)和 w(TP)呈極顯著正相關.Evenness指數與土壤土壤水分和w(TN)呈顯著正相關.w(EC)、pH值越小,土壤w(SOC)、w(TN)和w(TP)越大,土壤細菌群落的Shannon-Wiener和Richness指數越大.

表6 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落指數與理化參數的相關性分析Table 6 Pearson correlation analysis between different soil layers in different saline-alkaline soil bacterial community indices and physicochemical parameters

圖3 不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落-環境CCA排序Fig.3 CCA biplot of samples and environmental variables1～3:鹽土0～20cm深度土壤3個平行樣,4～6:強度鹽化土0～20cm深度土壤3個平行樣,7～9:輕度鹽化土0～20cm深度土壤3個平行樣;10、11:鹽土20～30cm深度土壤2個平行樣,12、13:強度鹽化土20～30cm深度土壤2個平行樣,14、15:輕度鹽化土20～30cm深度土壤2個平行樣

2.2.3 土壤細菌和理化性質的CCA分析 將DGGE圖譜中各條帶的灰度值作為物種數據,利用CANOCO進行去趨勢對應分析(DCA),所得結果中第1排序軸的梯度長度值為2.012,當該值介于1.5～3.0時,選擇線性模型做冗余分析(RDA)或者選擇單峰模型做典范對應(CCA)分析均合適.根據Legendre[31]分析理論,由于典范對應分析(CCA)每一步計算結果都可以和環境因子進行回歸,CCA排序能夠很好地反應物種在特征因子梯度上的分布,因此選擇CCA更合適.將物種數據與0～20cm,20～30cm土壤理化參數w(EC)、pH值、w(TP)、w(TN)、w(SOC)、土壤水分w(W)和土壤容重做CCA,第1排序軸和第2排序軸解釋了土壤細菌群落的21.3%和15.5%,總排序軸即所選的土壤環境理化因子對物種的總解釋量為81.7%,損失的信息只有18.3%.這說明土壤w(EC)、pH值、w(TP)、w(SOC)、土壤水分和土壤容重在研究鹽堿土土壤中的重要性.然而在鹽堿土壤中環境中可能還有其他理化因子對細菌群落結構產生影響.

圖3為不同鹽堿程度不同深度土壤細菌群落土壤-環境CCA排序圖.第1排序軸與w(EC)、pH值呈負相關,相關系數分別為-0.7695、-0.7038,說明橫坐標從左到右w(EC)、pH值逐漸降低;第1排序軸與土壤容重呈正相關,相關系數為0.7637,說明從左到右土壤容重逐漸增大.第2排序軸與w(SOC)、w(TN)和w(TP)呈正相關,相關系數分別為0.8871、0.8304和0.9659,說明縱坐標從下至上w(SOC)、w(TN)和w(TP)逐漸增大.w(EC)、pH值和土壤容重是影響鹽堿土壤中細菌群落結構的主要影響因子.由圖3可見,在0～20cm和20～30cm土層3種不同鹽堿程度土壤的分異明顯,而且各土壤平行樣一致性較好,均聚集在一起.w(EC)和pH值環境變量的長度都長于其他理化因子,也說明其在鹽堿土壤中對細菌群落的影響力最大.樣方垂直投影于射線上,沿著變量箭頭方向環境變量值增大.輕度鹽化土和強度鹽化土0～20cm的細菌群落適宜在高w(SOC)、w(TN)和w(TP)中生存,鹽土0～20cm的細菌群落適宜在高w(EC)、pH值生存.在20～30cm土壤中,輕度鹽化土中的細菌群落在土壤容重較大時適宜生存.

CCA分析結果表明,Monte Carlo測試的所有成分軸P <0.01,w(EC)、pH和土壤容重對鹽堿土壤的細菌群落存在顯著影響,并且w(EC)、pH值和土壤容重對鹽堿土壤細菌群落的影響力最大.

3 討論

在自然生態環境下的許多微生物不適宜在實驗室培養,因此用傳統的方法如平板計數法得到的微生物多樣性結果是非常片面的[32];碳素利用法(Biolog系統)僅能鑒定快速生長的部分微生物,只反應了潛在的而不是原位的代謝多樣性[33];而以PCR-DGGE技術為代表的分子生態學方法,因為無需培養且檢驗時間較短,相對較為先進和可靠.PCR-DGGE能很好的揭示不同程度鹽堿土壤中相關細菌較高的種群多樣性、遺傳多樣性和生態多樣性.

3.1 不同鹽堿程度土壤對細菌群落結構的影響

利用PCR-DGGE的研究方法得出,河套地區鹽堿土壤,在0～20cm層和20～30cm層土壤中,鹽土和強度鹽化土、輕度鹽化土細菌群落種類之間差異顯著.隨著鹽堿化程度的加深,土壤細菌群落的Shannon-Wiener指數和豐富度指數都顯著性降低.這與孫佳杰等[34]研究一致,土壤鹽化程度越高,土壤微生物數量越少,土壤微生物中細菌的數量從大到小依次為輕度鹽化土、中度鹽化土、重度鹽化土、鹽土.本研究表明,土壤中細菌群落的Shannon-Wiener指數與Richness隨土層深度的增加而顯著降低.潘雪蓮等[35]研究表明, 在0～30cm土壤深度范圍內,黃土高原微生物多樣性指數隨土層深度的增加而減少;張社奇等[36]在研究黃土高原刺槐林地土壤微生物垂直分布時發現土壤細菌群落對深度的變化極為顯著.

3.1.1 土壤鹽度和堿度對土壤對細菌群落結構的影響 土壤中鹽堿程度的加深主要表現為土壤鹽分的增加和pH值升高.相關性分析表明,3種不同鹽堿程度的土壤中細菌群落的Shannon-Wiener指數與Richness與土壤w(EC)、pH值呈顯著負相關.土壤鹽堿程度加深意味著土壤w(EC)和pH值越高,土壤細菌群落的多樣性和豐富度越低.土壤水溶性離子總量(簡稱土壤全鹽量)是衡量土壤鹽害程度大小的重要指標,土壤水溶性離子又是強電解質,其導電能力可用電導率w(EC)表示,并且二者具有正相關性,所以土壤w(EC)越高,鹽分越高,鹽害程度越嚴重[37].土壤微生物對w(EC)變化十分敏感,當土壤鹽分升高時,鹽分脅迫直接改變了微生物的生存環境,造成土壤微生物滲透脅迫,抑制和降低土壤活性微生物種群數量[38].李新等在利用PLFA方法研究鹽堿土壤微生物時發現,土壤鹽害程度越高,堿性越強土壤主要微生物多樣性越單一,反之則越豐富[39].康貽軍等[7],Yu等[40]指出,細菌數量與土壤全鹽含量呈顯著負相關,土壤鹽害程度越高,微生物數量越少,土壤細菌和真菌的數量分布從大到小為輕度鹽化土、中度鹽化土、重度鹽化土和鹽土.許多研究證明,在多種生態系統中pH通常與細菌群落結構有很好的相關性[41?42].

3.1.2 土壤有機碳、全磷等理化性質對土壤細菌群落結構的影響 3種不同鹽堿程度的土壤中細菌群落的Shannon-Wiener指數與Richness都與土壤w(SOC)和w(TP)呈極顯著正相關,與土壤容重呈顯著負相關.即土壤鹽堿程度越低,土壤w(SOC)和w(TP)越高,土壤細菌群落的多樣性和豐富度也越高.這與許多學者研究一致,隨著鹽堿程度的增加,土壤養分含量逐漸下降,N、P等含量明顯降低[43-46].水分條件是影響土壤中微生物生存和活性的一個重要因素,適當的土壤水分條件可以增加土壤微生物量和微生物活性[47].Griffiths等[48]研究指出,水分能明顯調節草地微生物多樣性,并會增加微生物本身對水的抗受性.而該研究表明,土壤水分w(W)與細菌Evenness指數呈顯著正相關,和Shannon-Wiener指數并不存在相關關系,可能與微生物在河套灌區這種極端干旱和鹽堿脅迫的條件下,已經適應了缺水的環境,土壤中的其他營養成分成為限制微生物活動的主要因子.

3.2 主要土壤細菌類群的分析

DGGE條帶經序列測定后發現,不同鹽堿程度土壤不同深度的優勢菌群不同.變形菌門細菌(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)、擬桿菌門(黃桿菌屬)和綠彎門(玫瑰彎菌屬)在不同鹽堿度土壤中均有分布.張廣志[9]在鹽堿土壤中分離鑒定耐鹽細菌時發現了黃桿菌屬和假單胞菌屬,并且在鹽濃度高達25%時,也能生存.有研究發現,假單胞菌屬細菌是一種耐鹽堿菌群,大多數種不需要有機生長因子,同時還可降解環境中廣泛存在的多種有機分子,在自然界和污染環境的礦化修復作用過程中有著重要地位.硫弧菌屬最適生長溫度在25～30℃,是硫酸鹽還原細菌,主要以硫酸鹽或其他的氧化態硫化物作為呼吸鏈的末端電子受體,以氫氣為電子受體,還原產物硫化氫.玫瑰彎菌屬(Rosebacter Shiba)是一種在堿性熱溫泉中發現的細絲狀不產氧光合細菌[50].食堿菌屬只有在相對高堿性和高鹽量的鹽土和強度鹽化土0～20cm層分布.劉艷等[51]研究深海熱液區微生物對深海環境響應機制時也發現了食堿菌屬,并證明了食堿菌屬具有適應高溫和大量硫的代謝特征.鞘脂單胞菌屬大部分是鞘氨醇單胞菌,存在于輕度鹽化土0～30cm,鹽土和強度鹽化土的20～30cm層.它們能廣泛的生存在各種水體、大氣、土壤甚至地球上的極端環境中.它們還能降解比較復雜的大分子有機物,也能產生有價值的高分子,還能利用簡單的小分子在極端貧瘠的環境中存活[52].

綜上可知,不同鹽堿土壤中的主要細菌都是耐鹽堿的細菌菌株.變形菌綱(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群.在所有測序條帶中,變形菌門占分析樣品總量的55%,其余為擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)和藍藻門.牛世全等[8]對河西走廊鹽堿土細菌種群多樣性的16S rDNA研究發現,原生鹽堿土中存在9大細菌類群,γ-變形菌為優勢菌群.石偉[11]對極端鹽堿土壤細菌的分離篩選及抗鹽特性研究顯示多數菌株屬于γ-變形菌綱(γproteobacteria).該研究表明內蒙古河套灌區鹽堿土壤細菌具有豐富物種、遺傳和發育系統多樣性.16S rDNA序列分析技術能夠在屬以上水平很好的反應細菌的分類.利用現代分子生物學技術分析細菌結構的基礎上,進一步對土壤微生物區系及其相互協同拮抗的代謝機制、以及與鹽堿環境之間的關系將成為今后研究的重點.

4 結論

4.1 內蒙古河套灌區鹽土、強度鹽化土和輕度鹽化土分別在0～20cm層和20～30cm層土壤細菌群落差異顯著,土壤鹽堿化程度越低,土壤細菌群落多樣性和豐富度越高,表現為輕度鹽化土>強度鹽化土>鹽土;0～20cm層與20～30cm層的土壤細菌群落也存在顯著性差異,隨著土層的加深,土壤細菌群落多樣性和豐富度減小.

4.2 CCA分析表明, w(EC)、pH和土壤容重對鹽堿土壤細菌群落結構的影響力最大.相關分析表明,土壤pH值、w(EC)越低,土壤w(SOC)、w(TN) 和w(TP)越高,土壤細菌群落的多樣性和豐富度也越高.

4.3 變形菌門(α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱)是鹽堿土壤的主要類群.鹽堿土壤中的菌株大部分都是屬于耐鹽堿的細菌菌株.

參考文獻：

[1] Niemi R M, Heiskanen I, Wallenius K, et al.Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE analysis of bacterial consortia [J].Journal of Microbiological Methods, 2001,45(3):155-165.

[2] 周德慶.微生物學教程 [M].北京:高等教育出版社, 1993.

[3] 黃昌勇.土壤學 [M].北京:中國農業出版社, 2000.

[4] 郭逍宇,董 志,宮輝力.再生水灌溉對草坪土壤微生物群落的影響 [J].中國環境科學, 2006,26(4):482-485.

[5] 侯憲文,吳建軍,徐建明.鉛-芐嘧磺隆對土壤微生物活性與群落結構的影響 [J].中國環境科學, 2007,27(6):738-742.

[6] 李海云,牛世全,孔維寶,等.河西走廊石羊河下游地區鹽堿土中放線菌多樣性—以民勤縣為例 [J].中國環境科學, 2015, 35(6):1805-1813.

[7] 康貽軍,胡 建,董必慧.灘涂鹽堿土壤微生物生態特征的研究[J].農業環境科學學報, 2007,26(S1):181-183.

[8] 曹國棟,陳接華,王紹明,等.不同鹽生植被類型下土壤微生物特性研究 [J].新疆農業科學, 2012,49(3):523-530.

[9] 張廣志,周紅姿,楊合同,等.鹽堿土壤中耐鹽細菌的分離與鑒定[J].山東農業科學, 2009,9:49-50.

[10] 牛世全,景彩虹,廖世齊,等.河西走廊鹽堿土細菌種群結構多樣性的研究 [J].西北師范大學學報, 2013(2):90-95.

[11] 石 偉,極端鹽堿土壤細菌的分離篩選及抗鹽特性研究 [D].哈爾濱:東北林業大學, 2011.

[12] 李鳳霞,郭永忠,許 興,等.鹽堿地土壤微生物生態特征研究進展 [J].安徽農業科學, 2011,39(23):14065-14067.

[13] 劉 鑫,魏占民,王長生,等.基于ArcGIS的河套灌區土壤鹽堿化空間分析 [J].人民黃河, 2011,33(12):88-91.

[14] 侯玉明,王 剛,王二英,等.河套灌區鹽堿土成因、類型及有效的治理改良措施 [J].現代農業, 2011,(1):92-93.

[15] Constancias F, Prevost-Boure NC, Terrat S, et al.Microscale evidence for a high decrease of soil bacterial density and diversity by cropping [J].Agronomy for Sustainable Development, 2014, 34(4):831-840.

[16] Sugden A M.Ecology: diversity and ecosystem resilience [J].Science, 2000,290(5490):233-235.

[17] 張 薇,魏海雷,高洪文,等.土壤微生物多樣性及其環境影響因子研究進展 [J].生態學雜志, 2005,24(1):48-52.

[18] Mann L, Tolbert V.Soil sustainability in renewable biomass plantings [J].Ambio, 2000,29(8):492-498.

[19] Walter K D, Margaret K B, Courtney S C, et al.Biological properties of soil and subsurface sediments under abandoned pasture and cropland [J].Soil Biology Biochemistry, 1997,28(7): 837-846.

[20] 馬悅欣, Holmstrom C, Webb J,等.變性梯度凝膠電泳(DGGE)在微生物生態學中的應用 [J].生態學報, 2003,23(8):1561-1569.

[21] 秦 楠,栗東芳,楊瑞馥.高通量測序技術及其在微生物學研究中的應用 [J].微生物學報, 2011(4):445-457.

[22] 李 丹,王秋玉.變性梯度凝膠電泳及其在土壤微生物生態學中的應用 [J].中國農學通報, 2011,27(3):6-9.

[23] 段學軍,黃春曉.重金屬鎘對水田土壤微生物基因多樣性的影響[J].應用與環境生物學報, 2008,14(4):510-513.

[24] Dong X L, Reddy G B.Soil bacterial communities in constructed wetlands treated with swine wastewater using PCR-DGGE technique [J].Bioresource Technology, 2010,101(4):1175-1182.

[25] Smalla K, Wieland G, Buchner A, et al.Bulk and rhizosphere,soil bacterial communities studied by denaturing gradient gel electrophoresis: plant-dependent enrichment and seasonal shifts revealed [J].Applied and Environmental Microbiology, 2001,67: 4742–4751.

[26] 王遵親.中國鹽漬土 [M].北京:科學出版社, 1993.

[27] 鮑士旦.土壤農化分析 [M].3版.北京:中國農業出版社, 2000.

[28] Lyautey E, Lacoste B, Ten-Hage L, et al.Analysis of bacterial diversity in river biofilms using 16S r DNA PCR-DGGE: methodological settings and fingerprints interpretation [J].Water Research, 2005,39(2/3):380-388.

[29] 陳法霖,張 凱,鄭 華,等.PCR-DGGE技術解析針葉和闊葉凋落物混合分解對土壤微生物群落結構的影響 [J].應用生物學報, 2011,17(2):145-150.

[30] Moschetti G, Aponte M, Blaiotta G, et al.Characterization of halophilic archaea isolated from different hypersaline ecosystems [J].Annals of microbiology, 2006,56(2):119-127.

[31] Lehendre P, Gallagher E D.Ecologically meaningful transformations for ordination of species data [J].Oecologia, 2001,129(2):271-280.

[32] 葉姜瑜,羅固源.微生物可培養性低的生態學釋因與對策 [J].微生物學報, 2005,45(3):478-482.

[33] Garland J L, Mills A L.Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization [J].Applied and environmental microbiology, 1991,57(8):2351-2359.

[34] 孫佳杰,尹建道,謝玉紅,等.天津濱海鹽堿土土壤微生物生態特征研究 [J].南京林大學學報:自然科學版, 2010,34(3):57-61.

[35] 潘雪蓮,黃 晟,方 昊,等.黃土高原土壤中細菌群落結構多樣性的PCR-DGGE分析 [J].生態與農村環境學報, 2009,25(3): 39-43.

[36] 張社奇,王國棟,田 鵬,等.黃土高原刺槐林地土壤微生物的分布特征 [J].水土保持學報, 2004,18(6):128?131.

[37] 尹建道,孫佳杰,郝志強,等.天津濱海地區土壤含鹽量與電導率的關系 [J].安徽農業科學, 2010,38(30):16882-16883.

[38] Garcia-Gil J C, Plaza C, Soler-Rovira P, et al.Long-term effects of municipal solid waste compost application on soil enzyme activities and microbial biomass [J].Soil Biology and Biochemistry, 2000,(32):1907-1913.

[39] 李 新,焦 燕,楊銘德.用磷脂脂肪酸(PLFA)譜圖技術分析內蒙古河套灌區不同鹽堿程度土壤微生物群落多樣性 [J].生態科學, 2014,33(3):488-494.

[40] Yu S, He Z L, Huang C Y.Advances in their search of soil microorganisms and their mediated processes under heavy metal stress [J].The Journal of Applied Ecoloyg, 2003,14:618-622.

[41] Christopher D C.Impact of cattle grazing and inorganic fertiliser additions to managed grasslands on the microbial communitycomposition of soils [J].Applied Soil Ecology, 2006,31(1/2):73?82.

[42] Singh B K, Nunan N, Ridgway K P, et al.Relationship between assemblages of my corrhizal fungi and bacteria on grass roots [J].Environmental Microbiology, 2008,10(2):534?541.

[43] Vega-Jarquin C, Garcia-Mendoza M, Jablonowski N, et al.Rapid immobilization of applied nitrogen in saline–alkaline soils [J].Plant and Soil, 2003,256:379–388.

[44] Fernandez-Luqueno F, Marsch R, Espinosa-Victoria D, et al.Remediation of PAHs in a saline–alkaline soil amended with waste water sludge and the effect on dynamics of C and N [J] .Science of the Total Environment, 2008,402:18-28.

[45] 張 杰,余 潮,王自海,等.不同植被群落表層土壤中細菌群落多樣性 [J].環境科學研究, 2013,26(8):866-872.

[46] Araujo A S F, Borges C D, Tsai S M, et al.Soil bacterial diversity in degraded and restored lands of Northeast Brazil [J].Antonie van Leeuwenhoek, 2014,106(5):891-899.

[47] Killham K.Soil ecology [M].Cambridge: Cambridge University Press, 1994.

[48] Griffiths R I, Whitelely A S, O'donnell A G, et al.Physiological and community responses of established grassland bacterial populations to water Stress [J].Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(12):6961-6968.

[49] 邵明安,王全九,黃明斌.土壤物理學 [M].北京:高等教育出版社, 2006.

[50] Hanada S, Takaichi S, Matsuura K, et al.Roseiflexus castenholziigen.nov.sp.nov., a thermophilic, filamentous, photosynthetic bacterium that lacks chlorosome [J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2002,52: 187-193.

[51] 劉 艷.深海熱液區微生物的篩選鑒定及對深海環境的響應機制 [D].山東:山東師范大學, 2009.

[52] 胡 杰,何曉紅,李大平,等.鞘氨醇單胞菌研究進展 [J].應用與環境生物學報, 2007,13(12):431- 437.

Soil bacterial community diversity under different degrees of saline-alkaline in the Hetao Area of Inner Mongolia.

LI Xin, JIAO Yan*, DAI Gang, YANG Ming-de, WEN Hui-yang (Chemistry and Environment Science College, Inner Mongolia Normal University, Huhhot 010022, China).China Environmental Science, 2016,36(1)：249～260

Abstract：Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) based on analyzing V3～V6 variable regions of bacterial 16S rDNA, were used to examine the microbial community structure and diversity in different saline-alkaline soils (saline soil, strongly salinized soil and slight salinized soil) and soil depths (0～20cm, 20～30cm) in the Hetao Area of Inner Mongolia.Their physical and chemical properties were measured, respectively.Experimental results showed that bacterial community structure and diversity decreased with the different saline-alkaline soil (slight salinized soil> strongly salinized soil> saline soil)and declined with soil depths (0～20cm>20～30cm).Shannon-Wiener index of bacterial community in slight salinized soil was the highest value (3.36), while it was only 3.05 and 2.49 in strongly salinized soil and saline soil.The cluster analysis of DGGE bands showed that the bacterial community structure and diversity formed two distinct clusters 0～20cm and 20～30cm.Shannon-Wiener index of bacterial community in 0～20cm layer (saline soil 3.04, strongly salinized soil 3.29, slight salinized soil 3.36) were higher than 20～30cm layer (saline soil2.49, strongly salinized soil 3.05, slight salinized soil 3.14).Analyses of Pearson correlation and CCA revealed that variations of bacterial community structure were mainly affected by contents of w(EC), pH, w(SOC), w(TP).The soil bacteria diversification index has a negative correlation with the w(EC)(r=-0.542,P<0.05)、pH(r=-0.526,P<0.05), and bacterial community diversity exhibited very significant positive correlation with w(SOC)(r=0.700,P<0.01) and w(TP)(r=0.805,P<0.01).w(EC) and pH were the the greatest influence in saline-alkaline soils.Twenty bands were excised from the DGGE gel and re-amplified for 16S rDNA sequencing.Based on the sequencing results, eleven bands can be identified as related to Proteobacteria.These results provide evidence that Proteobacteria are the domain bacterial communities in different saline-alkaline soilsbook=250,ebook=253of Hetao Area of Inner Mongolia.Saline-alkali soils were mostly bacterial strains belonging to tolerant salty.

Key words：Hetao Area；saline-alkaline soils；bacterial；DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis); principal component analysis

中圖分類號：X172

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6923(2016)01-0249-11

收稿日期：2015-05-18

基金項目：國家自然科學基金項目(41165010,41375144,41565009);2013內蒙古高等學校“青年科技英才”支持計劃資助(NJYT-13-B06);內蒙古師范大學研究生科研創新基金項目(CXJJS13044)

作者簡介：李 新(1987-),女,內蒙古烏蘭浩特人,在讀碩士研究生,主要從事土壤微生物多樣性研究.