HPLC法測定關節疏通膠囊中白蠟樹精苷的方法的建立

陳玉娟，王巍，于源華

（長春理工大學　生命科學技術學院，長春　130022）

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HPLC法測定關節疏通膠囊中
白蠟樹精苷的方法的建立

陳玉娟，王巍，于源華

（長春理工大學生命科學技術學院，長春130022）

摘要：通過高效液相色譜法（HPLC），建立一種檢測關節疏通膠囊中的主要香豆素類成分即白蠟樹精苷含量檢測的方法。采用線性關系、精密度試驗、8h穩定性試驗、重現性實驗、加樣回收率試驗等方法對關節疏通膠囊中的白蠟樹精苷的含量檢測方法進行開發，測定白蠟樹精苷在0.5196～2.5980μg（r =0.9999）范圍內呈現良好的線性關系，其中精密度試驗、8h穩定性試驗、重現性實驗、加樣回收率試驗的RSD值均小于2%，加樣回收率試驗中，平均加樣回收率為98.1%。對關節疏通膠囊中的主要成分白蠟樹精苷進行了定量分析，選擇334nm波長進行檢測，減少了雜質的干擾。結果表明此法線性關系好、精密度高、準確性和重現性好、前處理相對簡單，適合關節疏通膠囊中白蠟樹精苷的含量檢測。

關鍵詞：關節疏通膠囊；高效液相；白蠟樹精苷

水曲柳是木樨科梣屬植物，民間用其樹皮治療風濕、類風濕、骨痛等疾病，作用療效確切［1］。水曲柳葉中含有香豆素苷類成分，前期研究表明，水曲柳總香豆素苷有抗炎鎮痛之功效，對類風濕性關節炎的動物模型有明顯的抑制其類風濕病變進展的作用［2］。關節疏通膠囊是本課題組正在研究的一種治療類風濕關節炎的中成藥，其主要成分是從水曲柳（Fraxinus mandschurica Rupr.）中提取的總香豆素苷類［2］。根據《藥品注冊管理辦法》（局令第28號）要求，申報的新藥對其生產工藝和質量控制部分必須制定相應的可控的質量標準。水曲柳提取物中含量最多的香豆素苷類成分為白蠟樹精苷，白蠟樹精苷化學性質穩定，紫外吸收強；而《中國藥典》和其他的藥品標準中沒有白蠟樹精苷的檢測方法的描述。本文擬采用HPLC法建立一種定量測定關節疏通膠囊中的白蠟樹精苷的方法，為制定關節疏通膠囊的質量標準提供試驗依據。

1　材料和儀器

1.1試驗儀器

高效液相色譜（日本Shimadzu公司），配有SGU-20A3在線脫氣裝置，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進樣器，SPD-20A檢測器，LCsolution工作站，C18色譜柱（250×4.6mm，5μm，美國Phenomenex公司）。

1.2試劑和試驗材料

甲醇為分析純，購于Fisher Scientific公司，磷酸為分析純，購于北京化工有限公司，水為自制蒸餾水，白蠟樹精苷（mandshurin）對照品自制，純度≥99%。關節疏通膠囊試材為自制［2］，取水曲柳總香豆素提取物30g，硬脂酸鎂、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g等物質，總計250g，經過混勻、制粒、干燥、整粒、灌裝等工序得到關節疏通膠囊1000粒。

2　方法和結果

2.1HPLC測定條件［3］

流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（37∶63），流速1mL/min，柱溫30℃，檢測波長為334nm，進樣量10μL。

2.2對照品和樣品的配制

取白蠟樹精苷對照品8.66mg，加甲醇30mL溶劑，定容至10mL，經過0.22μm孔徑的濾膜過濾，得到濃度為866μg/mL的原液，備用。

取關節疏通膠囊內容物0.35g，加甲醇50mL超聲2次，每次10min，定容至100mL，取上清液用0.22μm的濾膜過濾，取續濾液備用。

2.3方法專屬性試驗［4］

取對照品溶液和供試品溶液，分別進樣10μL，結果見圖1，對照品溶液，根據峰面積歸一化法計算白蠟樹精苷的含量為99.45%，供試品溶液中其他峰與白蠟樹精苷的峰達到了基線分離，對白蠟樹精苷的測定沒有干擾。

圖1　高效液相色譜圖

2.4線性關系

分別精密量取白蠟樹精苷的對照品原液0.6mL、1.2mL、1.8mL、2.4mL、3.0mL定容至10mL，配成濃度梯度為51.96μg/mL、103.92μg/mL、155.88μg/mL、207.84μg/mL、259.8μg/mL的溶液，進樣10μL。進樣量與峰面積如表1和圖2所示，線性曲線為y=3E+06x+39348，線性相關系數r = 0.9999，說明進樣量在0.5196μg-2.5980μg之間，進樣量與所測峰面積成良好的線性關系。

表1　白蠟樹精苷的進樣量和所測峰面積值

圖2　白蠟樹精苷進樣量和所測峰面積的線性關系

2.5精密度試驗

精密量取白蠟樹精苷原液1mL加甲醇定容至10mL，連續進樣六次，結果見表2所示。

表2　精密度試驗結果

2.68h穩定性實驗

取供試品溶液，在配制完成后的0h、2h、4h、6h、8h時分別進樣10μL，結果見表3所示。

表3　8h穩定性試驗

2.7重復性試驗

稱取關節疏通膠囊內容物6份，每份約0.35g，精密稱量，按照樣品溶液配制方法，配制供試品溶液6份，進樣，結果見表4所示。

2.8加樣回收率實驗

經過重現性試驗測定關節疏通膠囊中白蠟樹精苷的含量為8.68%，取相同批次的關節疏通膠囊6份，每份約0.35g，精密稱量，加入已知量的白蠟樹精苷對照品，按照供試品溶液配制方法進行配制溶液，進樣，結果見表5。

3　討論

文獻中對于香豆素的含量測定方法很多，有采用HPLC法［5，6］，有采用LC-MS法［7］，有的采用紫外檢測法［8］。由于紫外檢測法雜質干擾嚴重，LC-MS法所用的儀器昂貴、需要專人維護，且費用高，為以后生產關節疏通的企業考慮，本文采用方法相對簡單、穩定、性價比高的HPLC法檢測關節疏通膠囊中的白蠟樹精苷。白蠟樹精苷在334nm有強的紫外吸收，而雜質的吸收相對較弱，本試驗采用334nm作為檢測波長。由于白蠟樹精苷有較弱的酸性，在甲醇-水作為流動相時有拖尾現象，所以把水換成0.1%磷酸水溶液以修正拖尾現象［9］。

關節疏通膠囊中的配方比例是：水曲柳總香豆素提取物30g，硬脂酸鎂、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g，總計250g，制成1000粒。經過上述重現性試驗測定關節疏通膠囊中白蠟樹精苷的含量為8.68%，已知關節疏通膠囊中水曲柳總香豆素提取物的比例12%（30/250），所以水曲柳總香豆素提取物中白蠟樹精苷的含量為72.3%。《藥品注冊管理辦法》（局令第28號）中規定“‘未在國內上市銷售的從植物、動物、礦物等物質中提取的有效部位及其制劑’是指國家藥品標準中未收載的從單一植物、動物、礦物等物質中提取的一類或數類成份組成的有效部位及其制劑，其有效部位含量應占提取物的50%以上”。關節疏通膠囊中白蠟樹精苷的含量大于50%，符合要求。

4　結論

采用HPLC法檢測關節疏通膠囊中的白蠟樹精苷，進樣量在0.5196～2.5980μg之間，r =0.999，說明進樣量與所測峰面積成良好的線性關系；其中精密度試驗、8h穩定性試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗的RSD值分別為0.13%、0.42%、0.61%、0.93%，均小于2%，說明精密度高，干擾少，重復性好，方法簡單可行。此方法可以用于對關節疏通膠囊質量標準的制定中。

表4　白蠟樹精苷的重現性試驗結果

表5　白蠟樹精苷的加樣回收率試驗結果

參考文獻

［1］陳玉娟，王會堂，賀驪鵬，等.水曲柳皮中化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，2009，44（15）：2146-2147.

［2］長春理工大學.一種治療類風濕性關節炎的水曲柳提取物：中國，CN 103110700 A［P］.2013-05-02.

［3］馮偉紅，王智民，張啟偉，等.一測多評法測定秦皮藥材與飲片中香豆素類成分的含量［J］.中國中藥雜志，2011，36（13）：1782-1789.

［4］趙友誼，孫浩，王鳴，等.HPLC法同時測定江蘇引種白芷中5個香豆素的含量［J］.中國野生植物資源，2013，32（1）：56-58.

［5］步達，姚曉，鄭紫婷，等.HPLC法測定明黨參組織培養物和栽培品種香豆素成分的含量［J］.天然產物研究與開發，2014，26（10）：1638-1643.

［6］羅杠，馬興霞，羅永明，等.HPLC同時測定金粟蘭植物中香豆素及倍半萜內酯類有效成分的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（1）：47-50.

［7］楊榮靜，衛碧文，高歡，等.高效液相色譜-串聯質譜法檢測玩具中5中香豆素類致敏性香味劑［J］.色譜，2012，30（2）：160-164.

［8］施婷婷，王建新，李希.白芷總香豆素類有效部位的純化工藝研究［J］.中藥與臨床，2015，6（1）：35-38.

［9］梁俊，鄭江萍，黃良永.虎杖配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究［J］.中國藥師，2015，18（4）：578-582.

Determination of Mandshurin in Guanjie Shutong Capsule by HPLC

CHEN Yujuan，WANG Wei，YU Yuanhua
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Abstract：To establish a new method for determination of mandshurin（one kind of coumarin）in Guanjie Shutong Capsule，high performance Liquid chromatography（HPLC）was employed. HPCE was used to determine the content of mandshurin by experiments as linearity，precision，stability，reproducibility and recoveries. The linear ranges of mandshurin was 0.5196～2.5980μg（r =0.9999）by HPLC，the RSD of precision，reproducibility，stability and recoveries were all less than 2%. And the average recovery by HPLC was 98.1%. A new method was established to determine mandshurin in Guanjie Shutong Capsule. The detection wavelength is 334nm，reducing the interference of impurities. The method is with good Linear relationship，high precision，and simple，rapid，reproducible，accurate. So HPLC is more suitable for determination of mandshurin in Guanjie Shutong Capsule.

Key words：Guanjie Shutong Capsule；HPLC；Mandshurin

中圖分類號：R917

文獻標識碼：A

文章編號：1672-9870（2016）02-0140-04

收稿日期：2015-04-17

基金項目：吉林省科技廳重點科技攻關項目（20140204052YY）

作者簡介：陳玉娟（1979-），女，講師，E-mail：jychenzxcv@163.com