1株產順式-4-羥基-L-脯氨酸基因工程菌的構建及發酵初步優化

王付才，張震宇，孫付保，姚動邦，周楊

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

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1株產順式-4-羥基-L-脯氨酸基因工程菌的構建及發酵初步優化

王付才，張震宇*，孫付保*，姚動邦，周楊

(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫,214122)

摘要順式-4-羥基-L-脯氨酸是一種可用于合成多種藥物和香料的手性結構物質。通過對L-脯氨酸順式-4-羥化酶基因的優化設計，并引入色氨酸串聯啟動子，構建出1株能表達L-脯氨酸順式-4-羥化酶的重組大腸桿菌JM109/pEHC4，從而可以將游離的L-脯氨酸轉化為順式-4-羥基-L-脯氨酸。對該菌株進行搖瓶發酵優化，得出優選培養基為(g/L)：葡萄糖10，甘油10，蛋白胨10，NaCl 6，FeSO4 ·7H2O 0.278，L-抗壞血酸0.528，(NH4)2SO(4 ) 5，K2HPO4 1，MgSO4 0.2，CaCl(2 )0.015，L-脯氨酸4。在該條件下發酵12 h，順式-4-羥基-L-脯氨酸的產量達到657.08 mg/L，比優化前提高了3.76倍；在24 h時產量達到1 582.75 mg/L。研究結果為順式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物轉化法生產提供了基礎。

關鍵詞L-脯氨酸順式-4-羥化酶；密碼子優化；重組大腸桿菌；微生物轉化；發酵優化

L-羥脯氨酸(L-hydroxyproline，L-Hyp)，是L-脯氨酸羥基化后的產物。根據其羥基化位置及空間結構的不同，可形成4種立體異構體：反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hyp)、順式-4-羥基-L-脯氨酸(cis-4-Hyp)、反式-3-羥基-L-脯氨酸(trans-3-Hyp)和順式-3-羥基-L-脯氨酸(cis-3-Hyp)。其中cis-4-Hyp是一種重要的手性結構物質，可以用于藥物以及香料制造。特別是在制藥領域，cis-4-Hyp可以防止前膠原折疊成穩定的三級螺旋構象，從而減少纖維化和腫瘤細胞生長過程中膠原的過度沉積[1-2]，因此其可用作抗纖維化、抗腫瘤[3]和抗高血壓藥物[4]。

在自然界中，cis-4-Hyp存在于鬼筆鵝膏毒性肽的水解產物鬼筆毒素中[5]，也以游離的形式存在于檀香木中[6]，但在哺乳動物系統中未知。目前cis-4-Hyp主要通過trans-4-Hyp的差向異構化反應[7]或者復雜的化學全合成[8]來獲得，然而差向異構化合成中用到的trans-4-Hyp本身就是一種價格昂貴的化學物質，而化學合成法生產cis-4-Hyp難度大，工藝繁瑣，生產成本高。與化學合成法相比，微生物轉化法生產cis-4-Hyp具有操作簡便、反應條件溫和、副產物少、無環境污染、成本低等多種優點，所以以微生物轉化法為基礎的cis-4-Hyp生產方法必然成為趨勢。

據報道，有多種微生物表現出L-脯氨酸順式-4-羥化酶(cis-P4H)活性[9]。2009年，HARA等[10]人首次發現可以將游離的L-脯氨酸轉化為cis-4-Hyp的微生物，包括百脈根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)以及苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)。并且發現cis-P4H屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族[10-11]，酶催化反應需要非血紅素亞鐵離子以及O2的參與。然而，其在cis-4-Hyp生產過程中需要用到有毒性的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，以及菌體培養與酶轉化過程分步進行的問題使得整個過程較為復雜并且增加了生產成本。目前，國內尚沒有微生物轉化法生產cis-4-Hyp的報道。

本研究中通過優化cis-P4H基因后，構建出1株適合在大腸桿菌中表達的含有色氨酸串聯啟動子(Ptrp2)的cis-P4H表達工程菌E.coliJM109/pEHC4。并對其發酵培養基進行優化，確定了cis-4-Hyp生產的最佳培養基組成及濃度，為以后的工業化生產奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

菌株E.coliBL21(DE3)、JM109、DH5α、W3110、SCS110為本實驗室保存；克隆表達載體pES(pUC19改造型)購于上海旭冠公司。

1.1.2酶和試劑

限制性內切酶EcoR I、Hind III和BamH I以及T4DNA連接酶、DNA Marker均購自Takara公司；胰蛋白胨、蛋白胨、DNA膠回收試劑盒和質粒小量抽提試劑盒均購自上海生工生物公司；cis-4-Hyp標準品購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；酵母提取物購自Oxoid公司；其他常用試劑均購自國藥試劑。

1.1.3培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10 ，酵母提取物5 ，NaCl 10 ，pH 7.0；固體培養基需加入15～20 g/L的瓊脂粉。初始發酵培養基(g/L)：葡萄糖10，甘油5，胰蛋白胨8，(NH4)2SO45，K2HPO41，NaCl 2，FeSO4·7H2O 0.278，MgSO40.2，CaCl20.015，L-脯氨酸 4，pH 6.5。

1.2實驗方法

1.2.1cis-P4H基因的優化

根據已公布的苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)的cis-P4H基因序列(其原始基因序列見NCBI Gene ID: 14808181)，在Jcat(http://www.jcat.de/)上進行密碼子優化，使目的基因更適合在大腸桿菌中表達，同時消除常用酶切位點，并將原始序列中的終止密碼子修改為TAAT強終止子，再使用RNAstructure 5.3軟件優化mRNA的二級結構。在經兩次優化的序列5’端加上Hind III，3’端加上BamH I酶切位點，以利于后續的操作。優化后的cis-P4H基因由上海旭冠公司合成并連接到pES載體上，即pES-hypc4。

1.2.2重組質粒的構建

在cis-P4H基因表達的過程中選用了不需要誘導劑的強組成型啟動子——色氨酸串聯啟動子(Ptrp2)。將已合成好的含cis-P4H基因的質粒pES-hypc4與本實驗室保藏含Ptrp2的載體同時經Hind III、BamH I雙酶切，膠回收后用T4DNA連接酶連接，構建重組質粒pES-Ptrp2-hypc4(pEHC4)。

1.2.3重組菌培養及cis-4-Hyp的微生物轉化方法

種子培養:挑取活化后的JM109/pEHC4單菌落接種到含有氨芐抗性的30 mL(250 mL錐形瓶)LB培養基中，37 °C，220 r/min培養大約8 h。發酵培養:按6%的接種量將種子液接入30 mL(250 mL錐形瓶)發酵培養基中，30 °C，220 r/min培養12 h。微生物轉化：過濾除菌后的4 g/L的底物L-脯氨酸在接種時一并加入培養基中，L-脯氨酸隨著菌體的生長和產酶過程一同轉化，12 h后測定發酵液中底物L-脯氨酸轉化為cis-4-Hyp的量。

1.2.4cis-4-Hyp濃度測定方法

參考文獻[12]利用氯胺T法測定，由于培養基的影響，其中空白對照實驗為10.74 mg/L。

1.2.5cis-P4H酶活測定

cis-P4H酶活測定參考文獻[9-10]進行，cis-P4H細胞活性以每1 g濕細胞的酶活性(U/g)表示，每分鐘催化生成1 μmol的cis-4-Hyp的酶活性被定義為1個單位的酶活(1 U)。酶活測定時，cis-4-Hyp的濃度利用氯胺T法測定。

1.2.6發酵培養基組分及濃度的選擇

實驗采用單因素條件對重組大腸桿菌JM109/pEHC4的發酵培養基進行優化，包括碳源葡萄糖(1、5、10、15、20 g/L)和甘油(0、2、5、10、15 g/L)、氮源來源(分別為8 g/L的玉米漿、蛋白胨、胰蛋白胨和酵母提取物)，及蛋白胨質量濃度(5、8、10、15、20 g/L)、硫酸亞鐵濃度(0.01、0.1、1、2 mmol/L)和氯化鈉質量濃度(2、4、6、8、10 g/L)。每個因素的實驗都是在上一因素實驗確定的最佳條件基礎上進行的。

2結果與分析

2.1cis-P4H基因的優化與合成

生物體之間密碼子使用偏愛性的差異導致了各種異源基因表達問題，但可以通過合理的基因優化設計來克服。按1.2.1方法優化cis-P4H基因，通過同義密碼子的替換調整mRNA的5’端結構，使起始密碼子后的數個堿基組成的密碼子翻譯口袋呈現打開狀態(圖1)。

圖1　cis-P4H基因mRNA 5’末端二級結構預測結果Fig. 1　Potential mRNA secondary structures around the ATG start codon of the unadjusted gene (A) and the adjusted gene (B)

2.2重組大腸桿菌表達載體的構建

目前cis-P4H基因表達所用到的啟動子都屬于誘導型T7啟動子[8,10]，該啟動子的表達需要IPTG的誘導，并且基因表達時需要嚴格控制誘導時間以及誘導劑濃度。由于IPTG具有一定的毒性，一些國家規定在生產人用重組蛋白的生產工藝中不能使用IPTG。因此，本研究通過引入不需要誘導的Ptrp2來解決上面的問題，并且有助于進一步降低生產成本。

按1.2.2方法，構建重組質粒pEHC4(圖2A)。將其轉化至E.coliJM109中，提取質粒經EcoR I和BamH I雙酶切后得到1 093 bp和2 692 bp左右的兩條片段(圖2B)，結果表明重組質粒構建成功。

1-DNA Marker DL15 000; 2-Double digestion of pEHC4 圖2　cis-P4H表達載體構建Fig. 2　cis-P4H expression vector construction (A) The profile of the recombinant plasmid. (B) EcoR I, BamH I Double digestion of pEHC4

2.3宿主菌的選擇及cis-P4H酶活分析

將測序正確的質粒pEHC4分別轉化至BL21(DE3)、JM109、DH5α、W3110、SCS110五種宿主菌中，分別測定5株重組菌的cis-P4H酶活及cis-4-Hyp產量，結果表明重組大腸桿菌JM109/pEHC4中的酶活最高，達到285.63 mU/g，同時，cis-4-Hyp產量達到174.90 mg/L(表1)。

表1　不同重組菌的cis-P4H細胞活性

注：a重組菌培養12 h后的cis-P4H細胞活性，測定見材料與方法；b無細胞空白對照。

2.4重組菌生長曲線及種齡的選擇

種齡對微生物發酵周期有著重要影響，種齡過嫩或者過老，不但延長發酵周期，而且還會降低產量，發酵中一般選擇菌種生長的對數中后期為宜。挑取E.coliJM109/pEHC4單菌落接種于LB中，培養方法按1.2.3所述。菌種OD600與時間的關系如圖3所示。

圖3　重組大腸桿菌JM109/pEHC4生長曲線Fig.3　The growth curve of recombinant E.coli JM109/pEHC4

從圖3可以看出，菌種接入LB后，4 h開始進入對數期，4～9 h為菌種的對數生長期，9 h后進入穩定期。一般而言，處于對數中后期的菌種活力最高而且性狀穩定，生命力強可以及時適應新環境。因此，選擇最佳種齡時間為7 h。

2.5發酵培養基單因素優化

2.5.1碳源葡萄糖質量濃度及甘油質量濃度對cis-4-Hyp產量的影響

對葡萄糖質量濃度的優化見圖4A。結果表明，隨著葡萄糖質量濃度的增高，cis-4-Hyp的產量隨之增加，在葡萄糖質量濃度為10 g/L時達到最大值。當葡萄糖質量濃度大于10 g/L時，cis-4-Hyp的產量和OD600值開始下降，因為發酵培養基初始pH為6.5，偏酸性，并且葡萄糖過量會加速菌體的呼吸，在通氣不足、溶氧不能滿足需要的情況下，其代謝中間產物如乙酸等[13]不完全氧化而積累，導致培養基pH下降，不僅會限制菌體的生長還會影響cis-P4H的酶活。一般將葡萄糖和緩慢利用的碳源組成混合碳源，這樣既有利于菌體的生長又有利于產物的形成。在葡萄糖質量濃度為10 g/L的條件下，對遲效碳源甘油濃度進行優化(圖4B)，結果表明甘油質量濃度在10 g/L時，cis-4-Hyp的產量達到最大，并且過高濃度的甘油并不利于產量的提升。

圖4　葡萄糖質量濃度(A)和甘油質量濃度(B)對cis-4-Hyp產量的影響Fig.4　Effect of glucose (A) and glycerol (B) concentration on the production of cis-4-Hyp

2.5.2氮源來源及其質量濃度對cis-4-Hyp產量的影響

對氮源進行單因素篩選發現其對菌體生長狀況的影響較顯著，酵母提取物雖然有利于菌體的生長，但是并不利于cis-4-Hyp的轉化生成。當蛋白胨作為氮源時，cis-4-Hyp的產量達到最大(圖5A)，其余產量大小依次為胰蛋白胨>酵母提取物>玉米漿。蛋白胨富含有機氮化合物，也含有一些維生素和糖類,不僅為微生物提供氮源還提供碳源以及生長因子等。對蛋白胨濃度進行優化后得出最佳濃度為10 g/L,結果表明繼續增加蛋白胨的濃度，并不利于cis-4-Hyp產量和OD600的提升(圖5B)。

圖5　氮源來源(A)和蛋白胨質量濃度(B)對cis-4-Hyp產量的影響Fig.5　Effect of different organic nitrogen(A) and peptone concentrations (B) on the production of cis-4-Hyp

2.5.3硫酸亞鐵濃度對cis-4-Hyp產量的影響

cis-P4H屬于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族，需要非血紅素亞鐵離子的參與。在L-抗壞血酸存在與否的條件下對發酵培養基中的亞鐵離子濃度進行優化，結果表明，cis-4-Hyp的產量最高時的亞鐵濃度為1 mmol/L左右(圖6)，而且適量的L-抗壞血酸增加了cis-4-Hyp的產量。這種效應被觀察到普遍存在于2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶家族中，一般解釋為L-抗壞血酸的存在能夠減少Fe2+催化過程中Fe3+的產生[8]。但是，在L-抗壞血酸濃度>3 mmol/L時，抑制作用占據優勢。

圖6　在L-抗壞血酸存在與否的條件下，FeSO4濃度(摩爾比FeSO4/L-抗壞血酸=1∶3)對cis-4-Hyp產量的影響Fig.6　cis-4-Hyp production at different concentrations of FeSO4 alone and in the presence of L-ascorbate(由于濃度范圍大小超過3個數量級，所以使用對數坐標)

2.5.4氯化鈉質量濃度對cis-4-Hyp產量的影響

脯氨酸的高親和力轉運通過由PutP基因[14]編碼的次級主動轉運系統介導。大腸桿菌中的Na+/脯氨酸轉運體(PutP)是一種充分表征的次級主動轉運體，脯氨酸進入細胞的跨膜轉運依賴于Na+或Li+的電化學梯度[15]。通過對NaCl濃度的優化發現，隨著濃度的增大菌體的OD600逐漸減小，濃度在6 g/L時cis-4-Hyp的產量最高(圖7)。

圖7　NaCl質量濃度對cis-4-Hyp產量的影響Fig.7　Effect of NaCl concentration on the production of cis-4-Hyp

2.6優化后發酵培養基的驗證

經過初步優化后得出最佳培養基(g/L)：葡萄糖10，甘油10，蛋白胨10，NaCl 6，FeSO4·7H2O 0.278(1 mmol/L)，L-抗壞血酸0.528(3 mmol/L)，(NH4)2SO45，K2HPO41， MgSO40.2，CaCl20.015，脯氨酸4，pH 6.5。對優化后的培養基進行驗證，相同的發酵條件下，12 h后cis-4-Hyp的產量達到657.08 mg/L，比優化前提高了3.76倍。并且隨著時間的延長產量繼續增加，在24 h達到1 582.75 mg/L(圖8)。

圖8　重組菌JM109/pEHC4發酵驗證Fig．8　Fermentation verification of recombinant E. coli JM109/pEHC4

3結論

cis-4-Hyp不僅可以用于香料制造而且可作為藥物中間體合成多種藥物，所以具有重要的商業價值。本研究通過從苜蓿中華根瘤菌中獲取cis-P4H基因，構建了pEHC4表達載體，并在大腸桿菌JM109中成功表達。在發酵初始即將底物L-脯氨酸一同添加到發酵培養基中，無需收集菌體作為酶源再進行催化的分步工序，通過一步酶催化反應生產cis-4-Hyp，簡化了工藝。并通過引入色氨酸串聯啟動子(Ptrp2)，在避免誘導劑IPTG使用的同時，進一步降低了生產成本。對培養基初步優化之后,重組菌JM109/pEHC4 12 h的cis-4-Hyp產量達到657.08 mg/L，比優化前提高了3.76倍。此外，由于添加的底物L-脯氨酸并未消耗完全，隨著時間的延長cis-4-Hyp的產量還會繼續增加。本方法為工業上生產cis-4-Hyp提供了良好的技術基礎。

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Construction ofcis-4-hydroxy-L-proline producing recombinantE.coliand preliminary optimization of its fermentation conditions

WANG Fu-cai, ZHANG Zhen-yu*, SUN Fu-bao*,YAO Dong-bang, ZHOU Yang

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China )

ABSTRACTcis-4-hydroxy-L-proline is a valuable chiral building block for the organic synthesis of pharmaceuticals and perfume. By optimizing the target gene and introducing a tryptophan tandem promoter recombinant strain expressing the L-proline cis-4-hydroxylases, E. coli JM109/pEHC4, was constructed. Through the expression of L-proline cis-4-hydroxylases, free L-proline was converted to cis-4-hydroxy-L-proline. The optimized medium composition contained glucose 10 g/L, glycerol 10 g/L, peptone 10 g/L, NaCl 6 g/L, FeSO4 ·7H2O 0.278 g/L, L-ascorbate 0.528 g/L, (NH4)2SO4 5 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 0.2 g/L, CaCl2 0.015 g/L, and L-proline 4 g/L. Finally, after fermentation under the optimal conditions for 12 h, cis-4-hydroxy-L-proline production reached 657.08 mg/L, which was 3.76 times higher than that before fermentation, and then reached 1 582.75 mg/L after 24 h. Microbial transformation by L-proline cis-4-hydroxylases is a potential approach for cis-4-hydroxy-L-proline production.

Key wordsL-proline cis-4-hydroxylases； codon optimization, recombinant Escherichia coli； microbial transformation； fermentation optimization

收稿日期：2015-09-07，改回日期：2015-11-16

基金項目：國家自然科學基金(30970058)；江蘇省自然科學基金(BK2012554)；工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)開放課題基金(KLIB-ZR200801)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602002

第一作者：碩士研究生(張震宇教授，孫付保副教授為通訊作者，E-mail:zhangzy@jiangnan.edu.cn;fubaosun@jiangnan.edu.cn)。