黃酒儲存期間4-乙烯基愈瘡木酚和香草醛的變化及影響因素

莫新良 ，徐巖，范文來

1(浙江工業 職業技術學院 黃酒學院，浙江 紹興，312000)　2(江南大學 釀酒科學與酶技術中心，釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇 無錫，214122)

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黃酒儲存期間4-乙烯基愈瘡木酚和香草醛的變化及影響因素

莫新良1*，徐巖2，范文來2

1(浙江工業 職業技術學院 黃酒學院，浙江 紹興，312000)2(江南大學 釀酒科學與酶技術中心，釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇 無錫，214122)

摘要對黃酒儲存過程中4-乙烯基愈瘡木酚和香草醛的變化及其影響因素進行了分析，同時對模擬黃酒儲存過程中添加純物質4-乙烯基愈瘡木酚后的產物進行了檢測。結果表明：隨著儲存時間的延長，4-乙烯基愈創木酚的含量總體變化趨勢在逐漸減少，而香草醛的含量始終在不斷增加,氧氣和溫度對這兩種物質的變化影響較大；黃酒中香草醛是通過4-乙烯基愈瘡木酚的氧化而形成；香草醛是模擬黃酒貯存過程中4-乙烯基愈創木酚減少的主要產物，有超過 80 % 的4-乙烯基愈創木酚轉化成了香草醛，其中有極小部分的愈創木酚和香草酸產生。結論是：黃酒儲存期間4-乙烯基愈瘡木酚的減少和香草醛的增加變化較顯著，香草醛是4-乙烯基愈創木酚降解的主要產物，氧氣和溫度有利于香草醛這種甜香物質的形成。

關鍵詞黃酒；儲存；4-乙烯基愈瘡木酚; 香草醛；阿魏酸；香草酸；愈瘡木酚

黃酒是我國最古老的傳統發酵酒，其特點是越陳釀香氣越濃郁。黃酒通過一定時間的儲存，其風味特征發生顯著變化，由新酒的口感粗糙爆辣，香氣單薄，轉化為陳酒的醇厚柔和、醇香濃郁，從而形成黃酒所特有的“陳香”[1-2]。因此，黃酒又稱“老酒”，意味著新釀制的黃酒往往需要經過一定時間的陳釀才能得到最終的成品。正是這種獨特的釀造工藝才造就了黃酒獨具特色的、復雜的風味特征。

黃酒由于其營養豐富且風味獨特而深受人們喜愛，而香氣是決定黃酒風味和典型性的重要因素。國內對于黃酒中的香氣成分及風味特征已經研究得較為全面深入[3-5]。已有的感官分析發現，我國黃酒主要具有曲香、醇香、甜香、藥香、煙氣香、焦糖香及蜂蜜香等典型香氣特征[5]。理化分析結果顯示，黃酒中的主要成分是水、乙醇和糖分，三者約占總量的 96%～97%，其他微量組分僅占 3%～4%,而決定黃酒的風味特征及品質的差異卻是這 3%～4%的微量組分[4]。

酚類化合物一直以來被認為是飲料酒中有重要貢獻的香氣物質。研究發現，酚類香氣化合物是對黃酒整體香氣貢獻最大的一類化合物，其中，4-乙烯基愈瘡木酚具有典型的煙氣香、草藥香及丁香的氣味，在黃酒中具有較高的香氣強度(香氣強度OSME > 3)[3-4]，是構成黃酒“藥香、煙氣香”的重要風味物質。香草醛又名香蘭素，具有令人愉悅的香莢蘭豆香氣及甜香氣[6]，在黃酒中具有最大的香氣強度(OSME >4)[3-4]，是使黃酒具有令人優雅的甜香特征的重要風味物質。

飲料酒中，4-乙烯基愈瘡木酚主要來源于阿魏酸的脫羧反應[7,9]，香草醛的形成比較復雜，目前報道其途經主要是在儲存過程由阿魏酸產生的4-乙烯基愈瘡木酚氧化而來[8-10]。已有研究發現，黃酒中的4-乙烯基愈瘡木酚來源于黃酒的麥曲，主要在發酵中由阿魏酸脫羧而得到[11]，香草醛主要在黃酒儲存中產生[12]。但有關黃酒儲存過程中這兩種物質如何變化，且影響因素有哪些，文獻中未見其報道。本工作擬分析黃酒中4-乙烯基愈瘡木酚和香草醛在儲存過程中含量變化情況及其影響因素，并對模擬黃酒儲存過程中4-乙烯基愈瘡木酚的主要降解產物進行分析，為豐富黃酒風格特點及高品質黃酒的開發和生產提供科學依據。

1材料與方法

1.1實驗材料和儀器

分析樣品為：由浙江地區機制生麥曲、腳踏生麥曲和上海地區機制生麥曲新釀制而成的原酒,分別命名為ZJJZ、ZJJT和SHJZ。

定量所需的標準品均為色譜純，4-乙烯基愈創木酚 (98%)，愈創木酚(98%),4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(98%)，香草醛(99%)，阿魏酸和香草酸，購自Sigma-Aldrich(中國)公司。無水乙醇為色譜純，美國TEDIA試劑公司。乙醚和氯化鈉為分析純，購自中國醫藥(集團)上海化學試劑公司。超純水自制(Milli-Q 系統，Millipore, Badford, MA, USA)。

高速冷凍離心機 J-E，美國 Beckman公司；水浴恒溫搖床振蕩器(SHA-2 型，瑞華儀器)；MPS2 自動進樣器，德國 Gerstel 公司；安捷倫氣-質聯用儀，Agilent 6890 GC-5973 mass selective detector (MSD )；GC-MS色譜分離柱為DB-FFAP (60 m × 0.25 mm i.d. × 0.25 m，J&W Scientific)；戴安高效液相色譜儀P 680，美國戴安有限公司；HPLC色譜柱 C18柱(Zorbax SB-Aq，2.5 m，250 mm×4.6 mm)。

1.2實驗方法

1.2.1標準溶液的配制

準確稱取一定量的4-乙烯基愈創木酚、愈創木酚和香草醛標樣分別用無水乙醇精確配制，再取一定量加入到模擬黃酒中配制成系列濃度梯度的標準溶液；用無水乙醇溶解4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮作為內標溶液。模擬黃酒由超純水和12.5% (vol) 乙醇配制得到，并用乳酸將其pH值調為4.0。

精確稱取一定量的阿魏酸和香草酸標準品，分別用甲醇配制得到 10 g/L的標準貯備液，再由貯備液配制一系列不同濃度標樣混合溶液，用高效液相色譜(HPLC)進行分析。

1.2.2樣品香氣物質的萃取分析

樣品香氣物質的萃取分析參照文獻[12]的方法。即用液-液微萃取結合氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)方法萃取分析樣品中的香氣物質。

1.2.2.1香氣物質的萃取

取15 mL黃酒樣品，加4.5 g NaCl 和內標4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮(終質量濃度為98.61 μg/L)，用 1 mL 重蒸過的乙醚萃取離心后，取上清液進行GC-MS分析。

1.2.2.2香氣物質的分析

GC條件：自動進樣器直接進樣，進樣量1 μL，不分流模式；He載氣流速為2 mL/min；進樣口和檢測器溫度均為溫度250 ℃；程序升溫方式：100℃ 保持2 min，10 ℃/min升溫至230 ℃，恒溫10 min；MS條件：電子能量70 eV，EI電離源，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍30～550 amu。

1.2.2.3香氣物質的定性與定量

物質的定性采用將未知物的譜圖和NIST 05a.L 質譜庫 (Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖進行比對，結合其相應標準品的保留時間進行對比來確定。

定量結果通過內標標準曲線計算，內標化合物為 4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮。每種待測物分別對應于該內標做標準曲線，每種化合物峰面積采用選擇特征離子法 (SIM)積分，利用待測物質和內標的相對峰面積比代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質在黃酒中的含量。

1.2.3樣品中不揮發性物質阿魏酸和香草酸的萃取分析

樣品預處理按照文獻[13]的方法。20 mL 樣品用 5 mL 的乙酸乙酯提取 3 次，真空干燥器吹干。殘留物再用一定量的50% 的甲醇液溶解，用 0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液用于 HPLC 分析。

色譜條件：進樣量 10 μL，柱溫 30 ℃，檢測波長320 nm，流動相流速1 mL/min，流動相為 0.01% 的醋酸溶液 (A)∶甲醇 (B)=7∶3，時間：起始時A 溶液 80%，保持 4 min，24 min 時 A 溶液降至 60%， 27 min 時 A 溶液降至 0% 持續 2 min，30 min 時又增至 80%，并保持5 min 使柱子平衡。

1.2.4黃酒煎酒及儲存

ZJJZ和ZJJT(分別含：乙醇12.1%和12.5% (vol) ，阿魏酸4.30 mg/L和5.98 mg/L， 4-乙烯基愈瘡木酚4.23 mg/L和5.74 mg/L，香草醛0.06 mg/L和0.08 mg/L)，90 ℃ 煎酒 30 min后，30 ℃儲存 9 個月，15 天檢測1次。

SHJZ(乙醇12.0% ，阿魏酸0.75 mg/L，4-乙烯基愈創木酚 2.40 mg/L，香草醛0.08 mg/L)，添加 2.41 mg/L 4-乙烯基愈創木酚，煎酒后，分別在常壓(atmosphere，簡寫為atm)、充滿O2(瓶中總的溶氧為 20.0 ～ 21.0 mg/L)、充滿 CO2和在 60 ℃ 的條件下儲存 15 d。

1.2.5 黃酒模擬酒煎酒及貯存

配制好的模擬酒添加純4-乙烯基愈創木酚(5.0 mg/L)，煎酒后，在 30 ℃下儲存一段時間，檢測分析其中的物質。

1.2.6黃酒酒精度的測定

參照 GB/T 13662—200，將樣品經過蒸餾，用酒精計測定餾出液中酒精的含量。

2結果與分析

2.1香氣物質分析方法驗證

為消除其他雜質峰的干擾，采用SIM方法對每個香氣化合物進行定量分析，化合物的定量離子見表1。

配制一系列濃度的4-乙烯基愈創木酚、香草醛及愈創木酚混合標準溶液，每個不同濃度水平的混合標準溶液重復測定6次，求得相應化合物的平均值。由內標標準曲線法進行線性回歸分析，并驗證了該方法的有效性，包括線性相關性系數、線性范圍、相對標準偏差、回收率、檢測限和定量限等，結果見表 1。

表 1　香氣物質的定量離子、標準曲線、線性范圍、相關系數、回收率、相對標準偏差、檢出限及定量限

由表 1 可知，方法所定量的化合物的線性關系較好，相關系數 在 0.999 5～ 0.999 8 之間。方法的準確度和精密度較好，回收率在 97.3% ～ 100.3% 之間，相對標準偏差均在 10% 以內，適于微量成分的準確分析。檢測限和定量限的變化范圍分別在 7.7～ 18.4 μg/L和 23.1～ 93.7 μg/L，均滿足相應香氣化合物的檢測要求。

2.2黃酒儲存過程中4-乙烯基愈創木酚和香草醛的變化

已有研究發現，黃酒中的4-乙烯基愈創木酚主要是在發酵過程由阿魏酸脫羧而得到，阿魏酸來自黃酒釀造過程中使用的特殊原料——麥曲，因小麥中含有高濃度的阿魏酸[11,14]。那么在儲存過程中，阿魏酸是否繼續轉化為4-乙烯基愈創木酚呢？研究也發現，香草醛在黃酒中主要是在儲存過程中產生[12]。為考察儲存過程中這兩種物質含量變化情況及時間的影響，用ZJJZ和ZJJT煎酒后，在 30 ℃的條件下儲存 9 個月，分析結果見圖 1 和圖 2。

由圖 1 和圖 2得知，在前45天的儲存過程中，4-乙烯基愈創木酚含量有所增加，說明這個階段阿魏酸經過非酶脫羧反應形成了4-乙烯基愈瘡木酚(因這兩種酒中還含有一定濃度的阿魏酸，分別為4.30 mg/L和5.98 mg/L)。但隨著儲存時間的延長，4-乙烯基愈創木酚的含量在逐漸減少(圖 1)，而香草醛始終在不斷增加(圖 2)。

—■—腳踏麥曲釀制的原酒(ZJJT)；—☆—機制麥曲釀制的原酒(ZJJZ)圖1　 浙江地區生麥曲釀制的原酒儲存在30 ℃ 條件下4-乙烯基愈創木酚含量的變化Fig. 1　Change of 4-vinylguaiacol during aging of fresh rice wine brewed with wheat Qu from Zhejiang area at 30℃

—■—腳踏麥曲釀制的原酒(ZJJT)；—☆—機制麥曲釀制的原酒(ZJJZ)圖2　浙江地區生麥曲釀制的原酒儲存在30 ℃ 的條件下香草醛的變化Fig. 2　Change of vanillin during aging of fresh rice wine brewed with wheat Qu from Zhejiang area at 30 ℃

香草醛可能來自阿魏酸的降解，而阿魏酸通過生化作用轉化為香蘭素的途徑已得到廣泛證實[8, 9]文獻報道，由阿魏酸降解產生香草醛的途徑復雜，主要有四條：非氧化脫羧反應、依賴于輔酶A的去乙酰反應、不依賴于輔酶A的去乙酰反應和側鏈還原[6]。其中在非氧化脫羧反應中，阿魏酸首先脫羧形成4-乙烯基愈創木酚，然后香草醛再由4-乙烯基愈瘡木酚氧化形成[6]。香草醛的這種形成途徑在其它飲料酒中也普遍存在[8-10]。由上述分析可以推測，黃酒中香草醛是通過4-乙烯基愈瘡木酚的氧化而形成的。

2.3黃酒儲存過程中重要香氣物質變化的影響因素

文獻報道，香草醛若通過4-乙烯基愈瘡木酚的氧化形成，則氧氣等催化劑及環境溫度對其產生有較大的影響[9]，因此本研究也從氧氣、溫度等方面來分析兩種物質在黃酒貯存過程中的變化。

表2　新酒SHJZ添加2.41 mg/L 4-乙烯基愈創木酚后，在常壓、O2 或 CO2和

注：同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.1黃酒儲存過程中氧氣對4-乙烯基愈創木酚和香草醛變化的影響

表2列出了SHJZ添加 2.41 mg/L 4-乙烯基愈創木酚后，在常壓、O2或 CO2和60℃的儲存條件下，4-乙烯基愈創木酚和香草醛的變化情況。

由表2可知，隨著儲存時間的延長，3種情況下的黃酒中4-乙烯基愈創木酚的含量均減少，同時香草醛的含量均已增加，含量變化極顯著(P<0.05)。在充氧的條件下，4-乙烯基愈創木酚含量的減少和香草醛含量的增加比常壓和充 CO2條件下變化的幅度更大。這種現象和文獻報道在啤酒的儲存過程中 4-乙烯基愈創木酚的減少和香草醛的增加情況相一致[9]。說明氧氣有助于這種化學反應過程的變化，原因是氧氣有利于 4-乙烯基愈創木酚雙鍵的氧化，因而有利于這種化學反應的轉變，因為黃酒經過 90℃ 以上的溫度煎酒后，基本上處于無菌狀態，微生物的生物反應幾乎不存在。

從表2中也發現，通過90 ℃的高溫煎酒后，黃酒中的4-乙烯基愈創木酚和香草醛的含量都有少量的增加，這主要是其中的少量阿魏酸(0.75 mg/L)，在較高溫度的熱效應作用下，發生快速脫羧反應形成了4-乙烯基愈創木酚后，又有部分氧化成了香草醛[14]。這種現象同日本燒酒的蒸餾過程和啤酒的麥汁煮沸過程中阿魏酸轉化成4-乙烯基愈創木酚，而后又形成香草醛的情況相似[8-9]。

2.3.2黃酒儲存過程中溫度對4-乙烯基愈創木酚和香草醛變化的影響

SHJZ添加 2.41 mg/L 4-乙烯基愈創木酚，充滿 O2后，在不同溫度下儲存，研究4-乙烯基愈創木酚和香草醛的變化情況，結果見表3。

表3　新酒SHJZ添加2.41 mg/L4-乙烯基愈創木酚后，充滿 O2 后儲存在4℃、30℃、60℃的條件下

注：同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

由表3可知，隨著儲存溫度的升高，二者的含量變化都極顯著(P<0.05)，4-乙烯基愈創木酚減少和香草醛增加的幅度均在提高，說明溫度對兩種物質的變化影響較大。這種現象和文獻報道的啤酒的儲存過程中4-乙烯基愈創木酚的減少和香草醛的增加情況相一致[9]。

2.4模擬黃酒儲存過程中添加4-乙烯基愈創木酚后物質的變化

為方便黃酒儲存過程中，其它物質的檢測和鑒定，用模擬黃酒來研究添加純的4-乙烯基愈創木酚后物質的變化情況，同時用不添加該物質的模擬酒做對照，在30℃ 條件下儲存一段時間，結果見表4。

表4　模擬黃酒添加5.00 mg/L 4-乙烯基愈創木酚后，

注：ND, 未檢測到；同列字母不同表示差異顯著(P﹤0.05)。

由表4可知，隨著儲存時間的延長，在模擬酒中能檢測到 3 種揮發性物質，即愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚和香草醛，同時還能檢測到 1 種不揮發性物質即香草酸(HPLC檢測)。并且隨著儲存時間的延長，4-乙烯基愈創木酚和香草醛含量變化顯著(P﹤0.05)，4-乙烯基愈創木酚從第1天的4.85 mg/L減少到第90天的2.94 mg/L，香草醛從第1天的0.04 mg/L增加到第90天的1.63 mg/L。綜合研究發現，有超過 80% 的4-乙烯基愈創木酚轉化成了香草醛，其中有極小部分的愈創木酚和香草酸產生，而且隨著儲存時間的延長，這兩種物質的含量變化不明顯。因此，在儲存過程中，香草醛是 4-乙烯基愈創木酚氧化的主要產物，其他兩種物質即愈創木酚和香草酸，只是其少量的副產物。而不添加 4-乙烯基愈瘡木酚的模擬酒中檢測不到任何物質。

3結論

黃酒儲存過程中，4-乙烯基愈瘡木酚和香草醛的含量發生明顯的變化，4-乙烯基愈創木酚在大量減少，香草醛在不斷增加，氧氣和溫度對這兩種物質的變化影響較大，香草醛主要是由4-乙烯基愈創木酚轉化而來。通過在模擬黃酒中添加4-乙烯基愈瘡木酚后，進一步證實香草醛是4-乙烯基愈瘡木酚的主要降解產物。

參考文獻

[1]周家騏.黃酒生產工藝[M].北京:中國輕工業出版社,1996:4-236.

[2]謝廣發.黃酒釀造技術[M].北京:中國輕工業出版社,2010:1-17.

[3]羅濤.清爽型黃酒香氣特征及麥曲對其香氣的影響[D].無錫:江南大學生物工程學院,2008.

[4]陳雙.中國黃酒揮發性組分及香氣特征研究[D].無錫:江南大學生物工程學院,2013.

[5]王棟,經斌,徐巖,等.中國黃酒風味感官特征及其風味輪的構建研究[J].食品科學,2013,34(5):90-95.

[6]PRIEFERT H,RABENHORST J,STEINBUCHEL A.Biote chnological production of vanillin[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2001,56(3-4):296-314.

[7]ROSAZZA J P N,HUANG Z,DOSTAL L,et al.Review:Biocatalytic transformations of ferulic acid:an abundant aromatic natural product[J].Journal of Industrial Microbiology,1995,15(6):457-471.

[8]KOSEKI T,ITO Y,FURUSE S,et al.Conversion of ferulic acid into 4-vinylguaiacol,vanillin and vanillic acid in model solutions ofshochu [J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1996,82(1):46-50.

[9]VANBENEDEN N,SAISON D,DELVAUX F,et al.Decrease of 4-vinylguaiacol during beer aging and formation of apocynol and vanillin in beer [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(24): 11 983-11 988.

[10]SPILLMAN P J,POLLNITZ A P,LIACOPOULOS D,et al.Accumulation of vanillin during barrel-aging of white,red, and model wines [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1997,45(7):2 584-2 589.

[11]MO Xin-liang XU Yan.Ferulic acid release and 4-vinylguaiacol formation during Chinese rice wine brewing and fermentation[J].Journal of the Institute of Brewing,2010,116(3):304-311.

[12]莫新良,徐巖,范文來.中國黃酒中香草醛的定性定量分析[J].食品與發酵工業,2012,38(12):133-137.

[13]李永紅,鄭志強,孫志浩.反相高效液相色譜法同時測定發酵液中的阿魏酸、香草酸和香草醛[J].分析化學,2004,32(3):409.

[14]FIDDLER W,PARKER W E,WASSERMANN A E,et al.Thermal decomposition of ferulic acid[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1967,15(5):757-761.

Evolution of 4-vinylguaiacol and vanillin as well as factors affected its change during the storage of Chinese rice wines

MO Xin-liang1*, XU Yan2, FAN Wen-lai2

1(College of Chinese Rice Wine, Zhejiang Industry Polytechnic College, Shaoxing 31200, China)2Centre for Brewing Science and Enzyme Technology, Laboratory of Brewing Microbiology and Applied Enzymology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTIn this paper, the change of 4-vinylguaiacol and vanillin as well as factors affected its change during the storage of Chinese rice wines were investigated. The products resulted from supplement of 4-vinylguaiacol in model solutions of Chinese rice wines were identified. Results showed that the contents of 4-vinylguaiacol were gradually decreased and the levels of vanillin were on the steady increase with prolongation of storage, and factors affecting its change were highly dependent on oxygen and temperature. Vanillin was shifted from 4-vinylguaiacol. Three compounds including vanillin, guaiacol and vanillic acid, were identified in model solutions after forced aging. Vanillin was found to be the main degradation product of 4-vinylguaiacol, and its formation was shown to account for up to 80% of the decrease of 4-vinylguaiacol.It could be concluded that the decrease of 4-vinylguaiacol and the increase of vanillin were obvious during the storage of Chinese rice wines, and vanillin was the main degradation product of 4-vinylguaiacol. Furthermore, oxygen and temperature contributed to the formation of a sweet compound named as vanillin.

Key wordsChinese rice wine; storage; 4-vinylguaiacol; vanillin; ferulic acid; guaiacol; vanillic acid

收稿日期：2015-10-09，改回日期：2015-10-30

基金項目：浙江省專業帶頭人專業領軍項目(Ij2013134)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602006

第一作者：博士，講師(本文通訊作者,E-mail:xinliangmo@163.com)。