煙草不育系與保持系線粒體DNA的重測序研究

昌洪濤++朱列書++彭妙++李安++魯柯佚

摘 要：基于重測序技術，對兩對不育系和對應的保持系材料的線粒體DNA進行重測序，統計并分析了不育系與保持系線粒體DNA編碼區序列的突變位點，探討了這些突變位點與煙草胞質不育的關系。對重測序結果比對分析可知：不育系和保持系在orf106b上具有一致的1個InDel位點，在orf138a、orf121b、orf129b和orf110b上具有一致的SNP位點，這些突變位點沒有造成不育系與保持系編碼區序列的差異，推測這些突變位點可能與CMS無關；不育系MSK326和MSK394在orf112a和orf103c上有相同的InDel位點；MSK326和MSK394在65個基因片段或開放閱讀框上有一致SNP位點，且這些突變沒有出現在保持系線粒體編碼區。這些基因片段或開放閱讀框上的InDel和SNP突變都導致了基因或開放閱讀框編碼序列的改變，并且造成了氨基酸的突變，推測可能與煙草CMS密切的相關。其中atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf25、nad6、nad7、orf108、orf239、orf129、sdh4等基因或開放閱讀框上的突變位點與報道研究一致，均被報道與煙草CMS存在密切的聯系。本研究所挖掘的這些大量基因片段上的InDel和SNP位點，不僅有助于煙草CMS機理的進一步研究，也為煙草不育系育種研究提供有力的遺傳工具。

關鍵詞：煙草；線粒體DNA；重測序

中圖分類號：S572 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.06.001

Re-sequencing Study on the Mitochondrial DNA of Tobacco Sterile Line and Maintainer Line

CHANG Hongtao1，ZHU Lieshu1，PENG Miao2，LI An2，LU Keyi1

（ 1.College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China； 2. College of Biological Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128， China）

Abstract：Based on the technology of re-sequencing in this study， resequencd the mitochondrial DNA of two pairs of tobacco material of sterile line and maintainer line， statisticed analyzed the differences in mitochondrial DNA sequence of sterile line and maintainer line， discussed the relationship between the mutation site and CMS. For the comparison analysis of resequencing date in this samples， can know that： the sterile line and maintainer line had one same InDel site in orf106b.The same SNP site were located in orf138a， orf121b ， orf129b and orf110b. These mutations had not make differences on coding sequence of sterile line and maintainer line， these mutations may had nothing to do with the CMS. The sterile lines MSK326 and MSK394 have the same InDel site in orf112a and orf103c. And they had the same SNP site in 65 genes or open reading frame. But the maintainer line had no mutations in these genes or open reading frame. These InDel and SNP had led to the changes of coding sequence in genes or the open reading frame. These mutant sites likely related to their CMS.Some of these mutant sites， including atp1， atp4， atp6， coxl， cox3， atp9， orf25， nad6， nad7， orf108， orf239， orf129 and sdh4 have been reported. This report have confirmed that these mutant sites likely related to their CMS. We had detected the large number of InDel and SNP sites in our research， this found not only helps to further study， also would offer powerful tools for tobacco germplasm identification and marker-assisted selectionin tobacco breeding.

Key words：tobacco； mitochondrial DNA； re-sequencing

重測序是指對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎上對個體或群體進行差異性分析。在全基因組水平上掃描并檢測與重要性狀相關的基因序列差異和結構變異，實現遺傳進化分析及重要性狀候選基因預測。由于其具有檢測全面、真實可靠、快速容易等優點，受到越來越多的關注。目前，國內外學者將基因組重測序廣泛運用在水稻、擬南芥、黃瓜、油菜等物種中，成功定位了黃瓜早花基因、水稻抗稻瘟病、不育性等基因。但是在煙草不育機理的研究中，仍然以通過SSR和RAPD標記以及基因克隆等分子技術為主，重測序技術在煙草不育機理研究中應用較少。

煙草雄性不育的形成十分復雜，目前廣泛認為是控制雄性不育性的遺傳物質發生了變異，導致煙株體內生理生化過程的改變，促使煙株細胞形態發生變化，從而形成雄性不育[1]。大量研究表明煙草雄性不育是細胞質與細胞核共同調節的結果，但主要是線粒體DNA上發生的一些變異或者缺失，導致線粒體功能遭到破壞而發生紊亂，花粉不能正常發育，造成花絲縮短、花粉囊枯皺等現象[2-3]，從而引起煙草雄性不育，即細胞質雄性不育（CMS）[4]。Nair認為胞質雄性不育性的遺傳因子位于線粒體基因組[5]。Bergman等[6]發現不育系線粒體基因atp1同orf274共轉錄本升高導致其ATP/ADP比率顯著降低是該不育類型不育的一個特點。趙婷等[7]和朱騰義等[8]分別獲得了不育系存在顯著相關性的atp6和coxII 基因 SNP 位點。劉齊元等[9]發現不育系和保持系線粒體基因組有明顯的差異，但是對胞質不育類型的煙草雄性不育分子機理尚未展開研究。

通過線粒體DNA重測序技術，對比分析不育系與保持系的線粒體DNA序列差異，得到與煙草雄性不育相關的SNP位點，以及系統的挖掘與煙草雄性不育形成相關的基因，為揭示煙草細胞質雄性不育的分子機理奠定實驗依據。對積極選育煙草雄性不育系，開辟煙草雜種優勢利用的新前景有其重要的實際意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗在湖南農業大學中南煙草實驗基地進行。以保持系K326、不育系MSK326、保持系K394和不育系MSK394等烤煙品種為材料，兩對材料是嚴格的同核異質材料。

1.2 試驗設計

試驗材料于2015年12月26日播種，采用漂浮育苗。成苗后，對材料進行遮光處理培養。選取長勢一致的黃化苗制備線粒體DNA。將制備好的符合要求的DNA樣品送測序公司重測序檢測。

1.3 mtDNA的制備

參考李文強等[10]和李鳳霞等[11]方法，改進GENMED公司高多糖/酚植物線粒體DNA萃取試劑盒提取方法制備本試驗材料線粒體DNA。

1.4 mtDNA的質量及純度檢測

取7.5 L mtDNA樣品與1.5 μL 6×loading buffer用穩壓電泳儀在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測。運用凝膠成像系統（美國Alpha Innotech公司）拍照保存。取1 μL mtDNA溶液，加超純水稀釋至100 μL，用Eppendorf BioOhotometer分光光度計測出A260/A280、A260/A230 及mtDNA濃度。將檢測符合的線粒體DNA送諾禾致源生物技術公司重測序。

1.5 數據處理與分析

分析得到的重測序結果，采用Excel2003和SPSS軟件進行。

2 結果與分析

2.1 煙草線粒體DNA的制備和檢測

2.1.1 煙草線粒體DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測 通過差速離心的方法，獲得煙草線粒體，然后使用線粒體DNA萃取試劑盒提取的線粒體DNA樣品，對樣品進行電泳檢測。由圖1可知樣品均條帶整齊、清楚，無拖尾現象，表明mtDNA純度較高，沒有發生降解，能夠滿足后續試驗的要求。

2.1.2 紫外分光光度法檢測煙草線粒體DNA純度 純凈的DNA的OD260/230應該大于2。當OD260/230小于2，表明溶液中有殘留的鹽類雜質及其他小分子物質。純凈的DNA的OD260/280為1.8。當OD260/280>1.9，表明溶液中有RNA污染；當OD260/280<1.6，表明溶液中有蛋白質、酚類等污染。

從表1可以看出，所有的樣品OD260/230在1.97～2.10之間，OD260/280在1.85～1.92之間，表明提取的DNA純度較高，幾乎沒有RNA污染，無蛋白質、酚類及其他鹽類物質污染，符合重測序要求。

2.2 不育系與保持系線粒體DNA重測序比較分析

2.2.1 不育系與保持系線粒體DNA的InDel和SNP統計與分析 InDel 是指基因組中小片段的插入和缺失序列。SNP（單核苷酸多態性）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，包括單個堿基的轉換、顛換等。圖2和圖3分別是各樣品的InDel和SNP統計結果。由圖2可知不育系MSK326的InDel個數為62個，高于保持系K326的12個；其中不育系MSK326中純合InDel個數為43，雜合InDel為19個；且其中插入類型為28個，缺失類型為34個。MSK394的InDel為70個，高于保持系K394的22個。其中不育系MSK394純合InDel和雜合InDel均為35個；且其中插入類型為31個，缺失類型為39個。圖3可知不育系MSK326和MSK394的SNP個數分別為770和766，高于保持系K326和K394的189和199；其中不育系MSK326中純合SNP個數為390，雜合SNP為380個；其中轉換類型為307個，顛換類型為463個，ts/tv為0.66，低于保持系K326的1.39。不育系MSK394純合SNP個數為341，雜合SNP為425個；且其中轉換類型為322個，顛換類型為444個，ts/tv為0.73，低于保持系K394的1.21（表2）。

2.2.2 不育系與保持系線粒體DNA的INDel分析 由表3可知保持系K326在編碼區的InDel只有一個，K394有兩個InDel存在；不育系MSK326的InDel有4個，MSK326有8個。三個樣品都在orf106b的177801位點存在缺失，且都是缺少了G堿基。不育系MSK326和MSK394存在兩個完全一致的InDel；orf112a的19845位點都存在缺失，且都是缺失堿基AAAAAGA；orf103c的227978位點都存在缺失，且都是缺失堿基CCTTAGAGTCAAGTGGCTTTCAGCTCCTCT。這兩個相同的InDel在保持系上不存在。不育系與保持系在這兩個基因上的序列不一致，有可能導致了編碼區的密碼子的變化，從而導致了氨基酸改變，推測可能與煙草CMS存在聯系。而orf106b 的177801位置上的缺失在K326，K494和MSK394中均有出現，但在MSK326中沒有，推測可能與CMS無必然聯系。

2.2.3 不育系與保持系線粒體DNA的SNP位點分析 由表4可知，orf138a、orf121b、orf129b上只在MSK394和K394存在一個相同位點的突變，K326和MSK326未出現；orf110b上MSk326和K326都存在一個相同位點的突變，K394和MSK394沒有。可推測這些只存在于各自不育系與相應保持系的突變位點可能與各自的某些不同性狀有關，與煙草雄性不育機理無關。只有K394在orf297a、orf121c上存在突變位點，而orf105a上只有K326存在突變位點。orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因雖然不育系上都存在突變位點，但是不育系材料的堿基序列與保持系材料一致；且在不育系材料中nad1和nad2雖然堿基發生了突變，但并未造成編碼的氨基酸改變，推測這些基因與CMS之間可能無必然聯系。不育系在nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf25、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、orf214、orf103b、orf119b、orf306、orf114a、orf147、orf166a、orf118、orf144、orf107、orf190、orf111c、cox3、orf125e、orf274、trnM、orf131b、orf202、nad6、rps4、ccmB、orf125g和orf141上均發生了突變，其中不育系MSK3426和MSK394在ccmC上有相同突變位點有10個，atp6上有5個，orf239上有11個，orf147有4個，orf274有7個，且這些突變沒有發生在保持系上或者與保持系突變位點不同。這些突變導致了不育系與保持系編碼區序列的差異，也改變了不育系上相關基因的編碼序列，造成了密碼子的改變，從而導致了氨基酸改變，影響了有關蛋白質的合成。推測這些差異突變可能與煙草CMS存在聯系。

2.2.4 SNP位點基因注釋以及與煙草不育相關性分析 atp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf25、orf239、orf129、sdh4等基因上出現的突變位點與前人研究報道一致，且目前已有這些基因上的SNP突變被證實與煙草CMS有關。其中atp1[12]、atp4[13]、atp6、atp9[14]都有過相關研究報道，這些基因都與ATP合酶的正常功能的發揮密切相關（表5）。ATP合酶是線粒體進行氧化磷酸化過程的關鍵酶。花粉發育是一個高耗能的過程，若某個或某些基因產物干擾了線粒體F0F1-ATP合成酶的功能，將可能導致花粉的敗育。Ashutosh等[15]研究發現，在帶有Moricandia arvensis胞質的芥菜中，線粒體基因上的orf 108與雄性不育有關；Yamamoto等[16]發現，orf129特異存在于甜菜CMS中。He S等[17]將嵌合基因ORF239轉入煙草核基因組，煙草花粉敗育，表明orf239與煙草雄性不育有關。張長靜等[18]研究表明不育系的sdh4基因第28位堿基發生了改變；以致其編碼蛋白改變，這極可能成為干擾線粒體琥珀酸脫氫酶亞基3功能的關鍵因素，從而成為可能導致煙草CMS的根本原因之一。

3 結論與討論

3.1 結 論

不育系MSK326和MSK394線粒體DNA序列上出現的InDel和SNP遠遠高于保持系K326和K394。這些基因組中小片段的插入和缺失核苷酸的變異影響了DNA序列上堿基的變化，改變了原來的密碼子，導致氨基酸變化，很可能與物種的某些性狀的出現有關。與保持系線粒體DNA相比，不育系線粒體DNA在orf112a和orf103c的相同位點上均出現了相同的堿基缺失，導致了不育系與保持系orf112a和orf103c上編碼序列的差異。目前還沒有出現過orf112a和orf103c與CMS相關的研究報道，但并不能否認orf112a和orf103c上的缺失就與煙草雄性不育的形成無關。

不育系在orf138a、orf121b、orf129b、orf110b、orf297a、orf121c、orf105a、orf101d、orf131c、trns、nad1、nad2等基因上都存在突變位點，但在保持系上同樣出現了相同的突變，導致不育系材料的堿基序列與保持系材料一致。且不育系材料中nad1和nad2雖然堿基發生了突變，但并未造成編碼的氨基酸改變，推測這些基因上的突變與CMS之間可能無必然聯系。不育系在線粒體DNA上的nad7、orf125a、mat-R、orf171a、ccmC、orf112a、atp6、orf177、orf110a、orf112a、orf112b、rpl5、atp1、orf161、orf151、rrn18、orf108、orf102b、ccmFN、cox1、rps10、orf315、orf129、rps13、atp9、orf237、orf239、orf134、orf214、nad6、sdh4、cox1、atp4、atp8、orf239、orf134、cox3、trnM、nad6、ccmB等均發生了突變，導致了不育系與保持系在編碼區序列的差異，并且堿基的改變造成了氨基酸的突變，推測可能與煙草CMS存在密切的聯系。其中ccmC，atp6，orf239，orf147，orf274等上突變位點較多。

目前，已有atp1、atp4、atp6、coxl、orf25、cox3、atp9、orf108、orf239、orf129、sdh4基因上的SNP可能與CMS相關已經被證實。其他基因上的SNP突變是否與CMS相關少有報道，有待于進一步研究。

3.2 討 論

煙草線粒體DNA的提取關鍵在于獲得高純度且完整的線粒體DNA。由于煙草既有細胞壁、液泡和葉綠體DNA等多種物質的干擾，又含高糖高酚；分離提取線粒體DNA的難度較大。經過對比實驗后，根據線粒體試劑盒方法，改進普通線粒體提取方法，得到的mtDNA電泳條帶清晰、無污染。使用幼嫩的黃化草葉片，容易使煙草組織破碎，提高了mtDNA的產率，也一定程度避免了葉綠體DNA的影響。

通過高通量重測序技術，挖掘的大量的InDel和SNP位點，其中不少SNP同時發生在不育系與保持系上，且突變位置相同。雖然這些SNP與煙草的不育機理無關，但是這些SNP是否與樣品的某些其它性狀有關。這些SNP的挖掘有助于進一步對K326和K394品種進行研究。結合前人的研究報道以及分子信息學的研究，那些導致不育系和保持系序列差異的SNP突變有一部分被證實與煙草CMS形成密切相關，如tp1、atp4、atp6、coxl、cox3、atp9、orf108、orf239、orf25、orf129、sdh4等。為揭示煙草細胞質雄性不育分子機理提供了直接的分子依據，也為進一步為創造新的不育性品種提供了可能。但還有大量的SNP位點與煙草雄性不育的相關性有待于進一步驗證，有助于進一步探究煙草雄性不育的形成機理。

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