應用新型LAMP檢測技術診斷犬副流感病毒感染

秦海斌　溫 海

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應用新型LAMP檢測技術診斷犬副流感病毒感染

秦海斌溫 海

注：本項目系公安部應用創新計劃項目（2007YYCXNJJQS161）及公安部技術交流培訓計劃項目

犬傳染性呼吸系統疾病，即“犬窩咳”是由多種細菌、病毒引起的，以發熱、咳嗽、流涕及呼吸困難等為臨床特征的犬類呼吸道感染性疾病，其中犬副流感病毒CPIV是主要致病微生物之一。CPIV屬于副粘病毒科副粘病毒屬，為單鏈不分節的負鏈 RNA 病毒，編碼8 個結構蛋白。迄今為止，CPIV感染已波及全世界，在我國亦出現了普遍流行的趨勢，病毒可廣泛感染伴侶犬、實驗犬和軍警犬，主要表現為發熱、流涕和咳嗽，也可引起急性腦脊髓炎和腦內積水，臨床表現為后驅麻痹和運動失調等癥狀，不僅嚴重危害犬類的健康生長，在軍犬和警犬中還能導致嗅覺障礙。

CPIV的病原學診斷以病毒分離、免疫熒光、血清學診斷、血凝/血凝抑制試驗、RT-PCR、膠體金快速檢測試紙條等方法為主，上述方法在靈敏度、準確性、特異性、時效性上存在一定缺陷，臨床診斷中仍缺乏一種簡便、快速、準確、靈敏、特異的診斷方法。環介導等溫擴增技術是一種新型的恒溫核酸擴增方法，在恒溫條件下40～60min即可完成核酸擴增反應，與其他的檢測技術相比，具有靈敏、特異、穩定、方便快捷、不需要特殊設備、結果判斷直觀的特點。本文利用LAMP檢測技術，建立了快速檢測CPIV病毒的LAMP檢測方法，并采集了2015年“犬窩咳”流行期間的發病犬鼻拭子25份，對LAMP檢測方法的臨床診斷性能進行了初步應用和評價，現將結果報告如下：

一、 LAMP檢測方法的建立

表1　CPIV-LAPM引物名稱及序列

（二）RNA模板的制備：以本實驗室保存CPIV細胞培養物為陽性對照，對臨床樣本進行檢測，RNA采用TaKaRa RNA提取試劑盒進行標準提取。

（三）LAMP檢測體系：LAMP反應總體積25 μL，5μL引物（1 μmol/L的F3，1 μmol/L的B3，8 μmol/L的FIP，8 μmol/L的BIP，4 μmol/L的LB，上述引物各1μL）、2.5 μL 10×ThermoPol反應緩沖液、4.0 μL 5.0 mmol/L Betaine、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs mixture、1μL （8 U） Bst DNA polymerise、1μL AMV（5 U/μL），5μL RNA模板，ddH2O補足體積到25μL。

（四）反應溫度的優選：LAMP方法在60℃～65℃范圍內均能實現高效的擴增，本文選擇63℃作為反應溫度，在LAMP實時濁度檢測系統LA-320中進行擴增，通過擴增速率曲線、擴增產物柱狀圖判定引物及檢測體系的優劣。圖1結果顯示63℃下的擴增的速率曲線良好，25～35min為擴增發生時間，45min內已經完成全部擴增，因此將反應條件優選為63℃恒溫擴增45min。

圖1 CPIV陽性樣本的LAPM擴增速率圖

圖2 CPIV-LAPM特異性鑒定柱1，CPIV GN株；2，CDV GN株；3，CAV GN株；4，CIV NJ株；5，BB-ATCC31124株；6，陰性對照。

二、LAMP特異性鑒定

針對“犬窩咳”中的主要致病微生物，提取CPIV GN株、CDV GN株、CAV GN株、CIV NJ株、BBATCC31124株的RNA/DNA，進行特異性驗證。圖2結果顯示，本文中建立的LAMP方法除了陽性對照物CPIV GN株的RNA能夠發生有效擴增外（柱1），對其他病原無擴增（柱2、3、4、5、6均為陰性擴增），方法具有良好的特異性。

三、靈敏度驗證

提取CPIV GN株的RNA，測定RNA濃度，然后進行10倍倍比稀釋作為樣本系列進行LAMP擴增，圖3結果顯示，RNA稀釋至105倍后仍然能夠擴增出條帶，以提取的RNA初始濃度為12.3μg/mL計算，本方法的檢測極限為0.62pg，靈敏度高。

四、LAMP結果可視化效果檢測

分別以CPIV GN株和蒸餾水作為陽性和陰性對照，在LAMP體系中按照1∶100的比例向LAMP反應管中加入SYBR Green I，擴增完成后在紫外照光下觀察本方法的目視化效果。圖4顯示陽性擴增產物可發出綠色熒光，陰性對照不發出熒光，證明本方法具備良好的目視化檢測能力。

五、與RT-PCR診斷方法的比較和應用

以CPIV GN株和蒸餾水作為陽性和陰性對照，對25份臨床病料應用LAMP、RT-PCR方法進行檢測，比較兩者的符合率和檢出率的高低，表2顯示，兩種方法的陽性、陰性符合率分別為81.8%、87.5%，LAMP方法在25分樣本中檢測出11份陽性樣本，比RT-PCR具備更高的檢出率。

圖3 CPIV-LAPM靈敏度鑒定1-8為CPIV GN株RNA由100稀釋至10-7。

圖4 CPIV-LAPM目視化檢測效果鑒定1、2為CPIV GN株；3、4為蒸餾水陰性對照。

表2　CPIV-LAPM與RT-PCR診斷效果比較

六、討論

CPIV是引起犬上呼吸道感染和腦脊髓炎的主要病原，在自然條件下，CPIV常與支氣管鮑特桿菌（BB）、2型腺病毒（CAV-Ⅱ）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬流感病毒（CIV）等混合感染，引起犬上呼吸道感染和嗅覺上皮損傷，對犬的健康和嗅探作業造成巨大障礙，但目前臨床診斷中仍缺乏CPIV病毒與其他窩咳病病原的快速有效的鑒別方法?；诖艘颍疚睦肔AMP技術建立了CPIV病毒的LAMP快速診斷方法，方法能在45min內判定結果，對窩咳病的其他病原無非特異性擴增，檢測下限為0.62pg RNA，能夠在水浴鍋中完成擴增，通過目視就能判定結果?？傮w上具備了快速、特異、靈敏、不依賴貴重設備、適于臨床檢測的基本特點，在初步的臨床應用中與RT-PCR相比展現出了更好的檢測效果。本文建立了一種具備良好檢測效果的CPIV病毒LAMP診斷方法，對犬窩咳病的防控具有重要意義，具有一定的推廣應用價值。

（作者單位：公安部南京警犬研究所，210012）

（編輯：李冰）

（一）引物的設計與合成：根據GenBank中登錄的CPIVNP基因序列，在NP基因保守區域設計5條LAMP引物（見表1），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。