褪黑素通過抑制P-選擇素表達減輕內毒素致大鼠急性肺損傷

張智,谷瑋瑋,馬蘊蕾,董宇杰,丁春華

(1.河北大學基礎醫學院,河北保定　071000；2.河北醫科大學第三醫院 實驗中心,河北石家　050017；3.河北省中醫院呼吸科,河北石家莊　050017；4.北京市結核病胸部腫瘤研究所病理科,北京　101149；5.河北醫科大學 病理生理學教研室，河北 石家莊　050017)

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褪黑素通過抑制P-選擇素表達減輕內毒素致大鼠急性肺損傷

張智1,谷瑋瑋2,馬蘊蕾3,董宇杰4,丁春華5

(1.河北大學基礎醫學院,河北保定071000；2.河北醫科大學第三醫院 實驗中心,河北石家050017；3.河北省中醫院呼吸科,河北石家莊050017；4.北京市結核病胸部腫瘤研究所病理科,北京101149；5.河北醫科大學 病理生理學教研室，河北 石家莊050017)

摘要：為探討P-選擇素(Ps)在內毒素(LPS)致大鼠急性肺損傷(ALI)時肺組織中的表達及褪黑素(MT)對其表達的影響,將SD大鼠隨機分為3組,對照(Control)組、模型(LPS)組、褪黑素干預(MT+LPS)組,采用氣管內滴注脂多糖(LPS)的方法建立大鼠ALI模型,光鏡下觀察大鼠肺組織形態學改變,采用免疫組織化學染色技術、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blot技術觀察肺組織中P-選擇素的表達變化.結果顯示：模型組較對照組肺組織損傷嚴重,P-選擇素的陽性表達明顯增多(P<0.05)；應用褪黑素干預后顯著緩解上述變化(P<0.05).這說明褪黑素可能通過抑制P-選擇素的表達發揮對急性肺損傷的保護作用.

關鍵詞：褪黑素；急性肺損傷；P-選擇素；脂多糖

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種原因引起的肺泡上皮、肺微血管內皮和肺間質的急性彌漫性損傷,也是臨床上一種常見的危重病癥,預后差,死亡率高,但其發病機制至今未完全闡明[1].研究表明,P-選擇素(P-selectin,Ps)在炎癥反應、血栓形成等多種病理生理過程中發揮重要作用,在ALI的發生發展過程中扮演了重要角色.褪黑素(melatonin,MT)是一種由松果體分泌的具有多種功能的神經內分泌激素,具有強烈的抗氧化應激作用,可對ALI時的肺組織起到保護作用[2-3].但是,褪黑素抗炎抗氧化作用的機制到目前仍不清楚.本實驗通過氣管內滴注脂多糖的方法復制急性肺損傷大鼠模型,觀察褪黑素抗急性肺損傷的作用,為褪黑素的應用提供一定的實驗基礎.

1材料與方法

1.1實驗動物

雄性SD大鼠24只,體質量200～240 g,由河北醫科大學醫學實驗動物中心提供,合格證編號：1005109.

1.2實驗試劑及設備

褪黑素(美國Sigma公司),脂多糖(美國Sigma公司),山羊抗Ps多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),電子天平(AE240,日本METTLER公司),低溫離心機(EBA12R,德國Hettich公司),組織勻漿器(PT-MR2100,瑞士Kinematica公司),石蠟切片機(RM2235,德國Leica公司),免疫組化試劑盒(北京中杉生物工程公司).

1.3急性肺損傷模型的制備

24只大鼠隨機分為3組,每組8只.Control組：氣管內滴注生理鹽水(200 μL/只)；LPS組：氣管內滴注LPS(200 μg/200 μL/只);MT + LPS 組：氣管內滴注LPS(200 μg/200 μL/只),并在滴注前后30 min分別腹腔注射MT(10 mg/kg).各組大鼠于手術6 h后處死取材.

1.4檢測指標和方法

1.4.1肺組織病理學改變

部分肺葉組織,采用40 g/L多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片,行蘇木素-伊紅染色,光學顯微鏡觀察肺組織病理學改變.

1.4.2肺組織中P-選擇素的表達變化

常規石蠟包埋切片,脫蠟水化,37 ℃山羊血清封閉30 min,一抗于37 ℃濕盒中孵育90 min,加入二抗,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復染,常規脫水、透明、封片.P-選擇素陽性表達于胞漿中,呈棕黃色顆粒,計算5個視野平均光密度(OD)的均值來代表該切片的OD值.

1.4.3逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測P-選擇素表達水平

處死動物取新鮮肺組織約50 mg,進行總RNA提取(Trizol法),用紫外分光光度計測定總RNA濃度及純度：分光光度計測定260 nm及280 nm處OD值,OD260/OD280值在1.8～2.0內純度較好.取總RNA 反轉錄合成cDNA,反應體系為：總RNA模板1 μg,Oligod(T)12-18Primer(10 μmol)2 μL,dNTP Mix(10 mmol total)2 μL,5× First-Strand Buffer 4 μL,RNase Inhibitor(40 U/μL)1 μL,TIANScript M-MLV(200 U)1 μL,加DEPC水至20 μL,混勻各管,37 ℃ 5 min；42 ℃ 1 h；95 ℃ 5 min.反應結束后,置冰上冷卻,取1 μL cDNA用于做PCR,剩余-80 ℃保存.用于擴增P-選擇素的引物序列如下：

上游引物：5-CCAATGTGTGAAGCCATCAA-3

下游引物：5-GACACTGTGCACTCCACATT-3,長度為164 bp.

以GAPDH做為內參,其引物序列為

上游引物：5-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3

下游引物：5-AGATCCACAACGGATACATT-3,長度為307 bp.

反應體系：cDNA模板1 μL,上游引物(20 μmol)0.25 μL,下游引物(20 μmol)0.25 μL,Taq酶 Mix(5 U/μL)5 μL,滅菌超純水至10 μL,擴增程序為：1)94 ℃,5 min；2)94 ℃,45 s；58～62 ℃,45 s；72 ℃,45 s；35個循環(退火溫度根據不同引物調整)；3)72 ℃,10 min.反應完畢后取PCR產物5 μL，經質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,在凝膠成像儀成像并進行灰度掃描分析.

1.4.4Western blot 技術檢測肺組織P-選擇素蛋白表達的變化

冰浴下制備100 g/L肺組織勻漿,采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量.加入2×SDS加樣緩沖液煮沸10 min,質量分數6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉膜,質量分數5%脫脂奶粉封閉,加入一抗,4 ℃靜置過夜.加入相應二抗,37 ℃ 1 h,DAB顯色.采用凝膠圖像分析系統進行分析.

1.5統計學處理

2結果

2.1光鏡下肺組織形態學改變

Control組肺組織清晰、完整,肺泡腔內無滲出液；LPS組肺組織損傷嚴重,肺泡間隔增寬,肺泡腔出血,間質內大量炎細胞浸潤；MT+LPS組上述病變明顯減輕(圖1).

a.Control 組;b.PS組;c.MT+LPS 組.圖1　各組大鼠肺組織病理學改變(HE染色,×400倍)Fig.1　Light micrographs of lung tissue structure (HE×400)

2.2肺組織P-選擇素免疫組化結果

Control組P-選擇素陽性信號較弱；LPS組的陽性信號明顯增強,主要分布于血管內皮細胞；MT+LPS組較與LPS組陽性信號減弱(P<0.05,圖2,表1).

a.Control 組;b.LPS組;c.MT+LPS 組.圖2　各組大鼠肺組織P-選擇素免疫組化表達結果(×400)Fig.2　Immunohistochemical micrographs of P-selectin expression in lung tissue(SP×400)

組別 OD值 Control組0.13±0.04LPS組0.36±0.07*MT+LPS組0.27±0.05#

*與Control 組相比P<0.05;#與LPS 組相比P<0.05.

2.3RT-PCR檢測Ps mRNA表達結果

應用RT-PCR方法檢測Ps mRNA表達量的變化,Ps mRNA大小為164 bp,內參GAPDH為307 bp.結果顯示,LPS組Ps mRNA表達水平與內參GAPDH比值(0.7325±0.1894)較Control組Ps mRNA表達水平與內參GAPDH比值(0.300 4±0.054 9)明顯升高,統計結果顯示顯著性差異(P<0.05).給予MT治療后,Ps mRNA表達與內參GAPDH比值(0.502 5±0.127 3)減少,統計結果與LPS組比較顯示顯著性差異(P<0.05),但Ps mRNA表達水平仍高于Control組(圖3,4).

*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs LPS group. 圖3　各組大鼠肺組織Ps mRNA表達結果 圖4　各組大鼠肺組織Ps mRNA/GAPDH比值Fig.3　mRNA level of P-selectin in Control group,LPS Fig.4　Level of Ps mRNA/GAPDH in Control group,group,and MT+LPS groupLPS group,and MT+LPS group

2.4肺組織Western blot檢測結果

應用Western blot方法檢測Ps表達量的變化,目的蛋白Ps分子質量為140 ku；內參β-actin分子質量42～43 ku.以內參β-actin蛋白表達量為參考標準,LPS組肺組織中Ps蛋白表達(0.718 1±0.074 2)與Control組(0.228 4±0.058 6)相比,明顯增多(P<0.05)；給予MT治療后Ps蛋白表達(0.483 7±0.013 3)與LPS組相比表達量減小，但仍高于Control組(P<0.05,圖5,6).

*P<0.05 vs Control group;#P<0.05 vs LPS group. 圖5　各組大鼠肺組織Western blot檢測結果 圖6　各組大鼠肺組織 P-selectin/β-actin比值　Fig.5　Result of P-selectin and β-actin expression in the Fig.6　Protein level of P-selectin/β-actin in Control group,

3討論

急性肺損傷(ALI)是由于心源性以外的各種肺內、肺外致病因素導致的急性、進行性、缺氧性呼吸衰竭,ALI 的嚴重階段即急性呼吸窘迫綜合征(ARDS).本實驗通過氣管內滴注LPS,病理學觀察發現肺泡間隔增寬,肺泡腔出血,間質內大量炎細胞浸潤,提示成功建立了ALI的動物模型.

正常情況下,P-選擇素(Ps)儲存在靜止血小板顆粒及內皮細胞的Weibel-palade bodies 中.在氧自由基、組胺等炎性介質的刺激作用下,血小板和內皮細胞被激活發生脫顆粒反應,P-選擇素轉移至胞膜表面,與表達于中性粒細胞等細胞上的相應配體結合,介導白細胞在內皮細胞上的粘附、活化,同時釋放炎性遞質[4-6].研究顯示：通過抑制實驗性結腸炎小鼠結腸組織Ps的表達,可以有效減輕炎癥反應[7]；降低肺血栓栓塞時 Ps 表達,可以減輕炎癥和凝血纖溶失衡對肺組織的損害[8].

褪黑素(MT)是由松果體分泌的一種神經內分泌激素,具有抗氧化應激、清除自由基、調節晝夜節律、抗腫瘤等多種功能.MT可以通過直接清除氧自由基、提高抗氧化酶的活性、減少自由基生成等方面發揮抗氧化作用[9].本室以往研究[10]發現,MT可以有效減輕ALI時肺組織的炎癥反應.為了進一步研究MT對ALI大鼠的保護作用機制,本實驗觀察了MT對肺組織Ps表達的影響.免疫組織化學染色、RT-PCR和Western blot結果均表明MT能明顯降低肺組織Ps的表達,減輕炎癥反應.

ALI發病機制十分復雜,至今尚未完全闡明.本實驗結果提示褪黑素可能通過抑制P-選擇素的表達,發揮對ALI時肺組織的保護作用.至于褪黑素通過何種途徑調節ALI的炎癥過程,還有待于進一步研究.

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(責任編輯：趙藏賞)

Melatonin inhibited P-selectin expression on acute lung injury induced by lipopolysaccharide in rats

ZHANG Zhi1,GU Weiwei2,MA Yunlei3,DONG Yujie4,DING Chunhua5

(1.College of Basic Medical Science,Hebei University,Baoding 071000,China;2.Experiment Center,The Third Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;3.Department of Respiration,Traditional Chinese Medicine Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050017,China;4.Department of Pathology,Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute,Beijing 101149,China;5.Department of Pathophysiology,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)

Abstract:To observe the expression of P-selectin(Ps) in lung tissues of acute lung injury(ALI) rat model induced by lipopolysaccharide(LPS) and examine the effect of melatonin(MT) to its expression all rats were randomly divided into three groups:Control group,LPS group and MT+LPS group.Lung tissues were imbedded by paraffin to observe morphological changes.The auther used immunohistochemical staining technique,reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot method to detect the expression of P-selectin.The results showed that compared with Control group,alveolar septum thickened significantly in LPS group,positive expression of P-selectin was very obvious(P<0.05);the administration of MT mitigated above changed significantly(P<0.05).The results suggested that MT possessed obvious protective effect on lung tissues during ALI,its protective mechanism might be related to the inhibition of the expression of P-selectin.

Key words:melatonin;acute lung injury;Ps;LPS

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2016.01.013

收稿日期：2015-03-12

基金項目：河北省科技廳資助項目(08276101D-88)

通信作者：丁春華(1954—),女,河北保定人,河北醫科大學教授,主要從事急性肺損傷研究.E-mail：dcp4@sina.com

中圖分類號：R96

文獻標志碼：A

文章編號：1000-1565(2016)01-0078-06

第一作者：張智(1982—),男,河北衡水人,河北大學實驗師,主要從事病理學基礎實驗研究.E-mail：zhzp13@163.com