紫外誘變復(fù)合重金屬離子抗性突變選育螺旋霉素高產(chǎn)菌株

劉守強(qiáng)，趙　中，劉　果，周淑梅，李愛(ài)玲，王留國(guó)

(1.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000；2.黃淮學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市環(huán)保局，河南 駐馬店 463000)

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紫外誘變復(fù)合重金屬離子抗性突變選育螺旋霉素高產(chǎn)菌株

劉守強(qiáng)1，趙中2，劉果1，周淑梅3，李愛(ài)玲1，王留國(guó)1

(1.天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000；2.黃淮學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)系，河南 駐馬店 463000；3.駐馬店市環(huán)保局，河南 駐馬店 463000)

摘要：以螺旋霉素鏈霉菌(Streptomyces spiramyceticus)YL0113-01為出發(fā)菌株，采用紫外線誘變，并以重金屬Co2+為篩選因子，獲得一株遺傳穩(wěn)定且螺旋霉素發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高6%的菌株。再對(duì)該菌株采用亞硝基胍(NTG)誘變，以纈氨酸結(jié)構(gòu)類似物L(fēng)-α-氨基丁酸作為篩選因子得到一株發(fā)酵效價(jià)較出發(fā)菌株提高14%的菌株。

關(guān)鍵詞：螺旋霉素；亞硝基胍誘變；紫外線誘變；重金屬Co2+；L-α-氨基丁酸

螺旋霉素是一種廣譜抗生素，主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌、部分革蘭氏陰性菌、立克次氏體及大型病毒所引起的感染[1]。在臨床應(yīng)用多年后，對(duì)感染性疾病的治療仍然有效，個(gè)別領(lǐng)域還有拓展的空間[2]。因此，提高螺旋霉素的工業(yè)化水平十分重要。

誘變育種是利用物理、化學(xué)等因素誘發(fā)生物體產(chǎn)生突變，從中篩選、培育動(dòng)植物和微生物新品種的方法。誘變隨機(jī)育種在菌種選育史上創(chuàng)造了輝煌的業(yè)績(jī)，但有益突變頻率仍然較低，變異的方向和性質(zhì)尚難控制。因此，提高誘變效率、迅速鑒定和篩選突變體以及探索定向誘變的途徑是當(dāng)前研究的重要課題。

螺旋霉素鏈霉菌生物合成螺旋霉素的過(guò)程受許多酶的調(diào)控。酰基激酶和酰基CoA合成酶是螺旋霉素內(nèi)酯環(huán)合成的重要酶，Co2+、Mn2+對(duì)酰基激酶和酰基CoA合成酶有較強(qiáng)的激活作用[3]，通過(guò)選育耐受高濃度Co2+的突變株，增加酰基激酶和酰基CoA合成酶活力，進(jìn)而提高螺旋霉素內(nèi)酯環(huán)合成能力，達(dá)到提高生產(chǎn)能力的目的。作者采用誘變與定向篩選相結(jié)合的方法篩選螺旋霉素鏈霉菌高產(chǎn)菌株，即根據(jù)螺旋霉素生物合成途徑的調(diào)控機(jī)制和本身的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，采用紫外線和亞硝基胍(NTG)進(jìn)行誘變，對(duì)重金屬離子和纈氨酸耐性突變型菌株進(jìn)行篩選，以獲得高產(chǎn)菌株。

1實(shí)驗(yàn)

1.1菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

螺旋霉素鏈霉菌(Streptomyces spiramyceticus)YL0113-01，天方藥業(yè)有限公司。

平板、斜面培養(yǎng)基(%)：玉米淀粉4，淀粉酶0.03，黃豆餅粉1，氯化鈉0.4，七水硫酸鎂0.05，碳酸鈣0.5，瓊脂2。平板菌落28 ℃培養(yǎng)12d后，挑選單菌落接種到斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)12d。

種子培養(yǎng)基(%)：淀粉4，黃豆餅粉1，蛋白胨 0.5，氯化鈉0.2 ,玉米漿0.5，pH值6.7。將成熟斜面孢子挖塊接種到種子培養(yǎng)基中，置于旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)上于220r·min-1、28 ℃培養(yǎng)48h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(%):淀粉5，魚粉1.5，玉米漿1.5，磷酸二氫鉀0.3，黃豆餅粉1.0，氯化鈉0.6，硝酸銨0.5，硫酸鎂0.05，豆油0.3，pH值6.7。取種子培養(yǎng)液10%(體積分?jǐn)?shù))移種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)上220r·min-1、28 ℃培養(yǎng)96h。

1.2高產(chǎn)菌株的誘變與篩選

1.2.1紫外線照射誘變處理

單孢子菌懸液制備：將成熟新鮮斜面孢子用鏟子刮下，接種到含無(wú)菌生理鹽水及玻璃珠的瓶子中，充分搖動(dòng)5min，使孢子盡可能分散，然后經(jīng)滅菌后的單層擦鏡紙過(guò)濾，制得單孢子菌懸液用于誘變處理。

紫外線照射誘變：吸取單孢子菌懸液6mL于含磁針的平板中，置于30W的UV燈(253.7nm)下30cm處，振動(dòng)照射處理，殺死率控制在90%左右。然后轉(zhuǎn)入含1.2mmol·L-1Co2+的瓊脂培養(yǎng)基中于28 ℃避光培養(yǎng)12d，挑取長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行搖瓶初篩、復(fù)篩，考察效價(jià)，獲得高產(chǎn)突變菌株。

1.2.2NTG化學(xué)誘變處理

將獲得的高產(chǎn)菌株斜面孢子涂布于含NTG的梯度培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)12d，挑選NTG梯度高的一側(cè)剛好長(zhǎng)出的菌落于含L-α-氨基丁酸(濃度為0.6mg·mL-1)的種子培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48h后稀釋涂布于培養(yǎng)基平板上，28 ℃再培養(yǎng)12d，挑取長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行發(fā)酵效價(jià)考察。

1.3發(fā)酵液的效價(jià)測(cè)定

螺旋霉素化學(xué)效價(jià)測(cè)定采用硫酸水解法，螺旋霉素在231～232nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰，本身帶有發(fā)色基團(tuán)，遇濃硫酸或鹽酸反應(yīng)后呈紫色，并在480nm處有最大吸收峰，可定量測(cè)定。

2結(jié)果與討論

2.1Co2+用于篩選螺旋霉素高效價(jià)菌株

2.1.1菌株對(duì)重金屬Co2+的耐受濃度考察

向種子培養(yǎng)基中添加不同濃度的Co2+，考察菌株YL0113-01的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1菌株YL0113-01在含不同濃度

Co2+培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

Tab.1　Growth of strain YL0113-01 in medium

由表1可知，當(dāng)Co2+濃度較低時(shí)，不影響菌株的生長(zhǎng)，種子液菌濃正常；當(dāng)Co2+濃度達(dá)到1.2 mmol·L-1時(shí)，就開(kāi)始對(duì)菌株生長(zhǎng)有了抑制作用，搖瓶外觀較稀，掛壁較少；當(dāng)Co2+濃度過(guò)高時(shí)，則明顯抑制菌株的生長(zhǎng)。1.2 mmol·L-1濃度的Co2+已影響了菌株的代謝過(guò)程，因此，可以利用這個(gè)敏感濃度位點(diǎn)對(duì)菌株進(jìn)行誘變后的篩選，以得到高產(chǎn)螺旋霉素的突變菌株。

2.1.2耐受Co2+突變菌株的篩選

將經(jīng)紫外線照射后的單孢子菌懸液加到含1.2 mmol·L-1Co2+的瓊脂培養(yǎng)基中于28 ℃避光培養(yǎng)12 d，挑取長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行搖瓶初篩、復(fù)篩，考察效價(jià)。經(jīng)搖瓶初篩，只有2株單菌落發(fā)酵效價(jià)高于出發(fā)菌株 YL0113-01。將所得的2株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩后再分離純化得到1株比出發(fā)菌株YL0113-01效價(jià)提高6%的突變菌株。

2.2NTG誘變獲得耐受高濃度L-α-氨基丁酸的突變菌株

纈氨酸等氨基酸代謝可產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸，L-纈氨酸提供螺旋霉素內(nèi)酯環(huán)中丁酸和丙酸單位，能刺激螺旋霉素的生物合成[4]。 L-α-氨基丁酸是螺旋霉素前體的結(jié)構(gòu)類似物，用來(lái)定向篩選耐前體的突變菌株。以2.1.2篩選得到的高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，用NTG誘變，經(jīng)L-α-氨基丁酸篩選后挑取長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行搖瓶效價(jià)考察，得到5株發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株高6%的突變菌株，對(duì)其進(jìn)行分離純化，搖瓶復(fù)篩后獲得1株發(fā)酵效價(jià)比NTG誘變前提高8%的突變菌株YL0235-06。

2.3突變菌株分離純化及菌落形態(tài)變化

對(duì)經(jīng)抗性選育得到的高產(chǎn)螺旋霉素突變菌株YL0235-06相繼進(jìn)行2次自然分離，得到菌落結(jié)構(gòu)緊密、形態(tài)單一、產(chǎn)量較高的菌株YL0240-05，并用于后

續(xù)的生產(chǎn)性實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)對(duì)YL0240-05和YL0113-01菌落外觀對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者間有較大差異，YL0113-01呈圓形、規(guī)則、有凸起菌落，而 YL0240-05菌落中央凸起，呈對(duì)稱性放射褶皺狀。

2.4高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性考察

用群體連續(xù)傳代的方法考察菌株YL0240-05的傳代穩(wěn)定性。通過(guò)連續(xù)三代斜面?zhèn)鞔⑦M(jìn)行效價(jià)考察發(fā)現(xiàn)，該菌株三代間效價(jià)波動(dòng)幅度小,第三代斜面效價(jià)是第一代斜面效價(jià)的98%。說(shuō)明菌株YL0240-05的高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。

3結(jié)論

采用紫外線照射、亞硝基胍化學(xué)處理螺旋霉素鏈霉菌YL0113-01菌株，通過(guò)重金屬離子和纈氨酸的推理選育方法，經(jīng)過(guò)多次分離篩選最后獲得YL0240-05高產(chǎn)突變菌株，其發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株累計(jì)提高14%，達(dá)到預(yù)期目的。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳亞銘.硝酸銨添加量對(duì)螺旋霉素發(fā)酵影響的初探[J].現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，1992,9(5):221.

[2]朱峰，王爾健．螺旋霉素的再評(píng)價(jià)[J]．中國(guó)抗生素雜志，1991,16(3):231-236.

[3]李友元,陳長(zhǎng)華,李永東,等.酰基激酶和酰基CoA合成酶對(duì)螺旋霉素合成的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào),2001,27(3):251-253.

[4]LEBRIHI A，LAMSAIF D，LEFEBVRE G,et al.Effect of ammoniumions on spiramycin biosynthesis inStreptomycesambofaciens[J].Applied Microbiology and Biotechnology，1992，37(3):328.

Screening Spiramycin High-Producing Strain with UV and Heavy Metal Ion Resistance Mutation

LIU Shou-qiang1，ZHAO Zhong2，LIU Guo1，ZHOU Shu-mei3，LI Ai-ling1，WANG Liu-guo1

(1.TopfondPharmaceuticalCo.，Ltd.，Zhumadian463000，China；2.DepartmentofMathematicalSciences，HuanghuaiUniversity，Zhumadian463000,China；3.EnvironmentalProtectionBureauofZhumadian，Zhumadian463000，China)

Abstract：A parent strain Streptomyces spiramyceticus YL0113-01 was treated by UV and using heavy metal Co2+as a screening factor.A stable strain was obtained with fermentation titer increased by 6% than parent strain.Then the mutant was treated by NTG with L-α-amino-butyric acid(an analogue of valine) as a screening factor,and a strain with fermentation titer increased by 14% than parent strain was obtained.

Keywords：spiramycin；nitrosoguanidine mutation；UV mutation；heavy metal Co2+；L-α-amino-butyric acid

基金項(xiàng)目：NSFC-河南人才培養(yǎng)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目(U1304104)

收稿日期：2016-01-16

作者簡(jiǎn)介：劉守強(qiáng)(1967-)，男，河南確山人，高級(jí)工程師，從事抗生素發(fā)酵工藝研究，E-mail：junzhongzhongxin01@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.05.006

中圖分類號(hào)：TQ 465.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)05-0026-02