A型流感病毒非結構蛋白NS1的研究進展

潘朋歌

(保諾科技(北京)有限公司，北京 102200)

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A型流感病毒非結構蛋白NS1的研究進展

潘朋歌

(保諾科技(北京)有限公司，北京 102200)

摘要對NS1蛋白的進化、結構、調節病毒的致病性等進行了綜述，在此基礎上，對抗流感病毒藥物及其防控技術進行了展望，以期為流感病毒的預防和治療提供更多的可能性。

關鍵詞A型流感病毒；非結構蛋白NS1；致病性；功能；結構

A型流感病毒屬正黏液病毒科RNA病毒屬，是一種嚴重危害人類及禽畜健康的病毒，感染人、禽、豬等20種以上的物種。其基因組為單股負鏈RNA，包含8個大小不同的RNA片段，其中第8條RNA編碼非結構蛋白1，即NS1，全長約230 aa，是A型流感病毒唯一的非結構蛋白。它只在已感染病毒的細胞中存在，而單個病毒粒子無NS1，因此被稱為非結構蛋白。NS1對流感病毒的致病性、毒力具有重要的調節作用，其功能位點氨基酸具有很強的遺傳保守性。而流感病毒的高度變異性，限制了流感疫苗的使用，常用的抗流感藥物也逐漸出現耐藥性，因此對NS1的深入研究，將為臨床診斷和預防A型流感病毒提供更多的可能性。筆者對NS1蛋白的進化、結構、功能等方面進行了綜述，在此基礎上，對抗流感病毒藥物及其防控技術進行了展望。

1NS1基因的分群及進化分析

NS1蛋白由NS基因編碼。根據NS基因序列的同源性，可將NS基因劃分成2個等位基因群：A和B。群內基因具有較高的同源性，高達90%；群和群之間的同源性則只有72%左右[1]。Ludwig等[2]研究發現，基因群A編碼所有的人、豬、馬的流感病毒和部分禽流感病毒的NS1蛋白，而基因群B則編碼其余的禽流感病毒NS1蛋白。Suarez等[3]選取106株來自不同地區的A型流感病毒株，對其NS基因進行分析，結果表明，基因群A、B分別被細分為5個分支和2個分支。William等[4]選取40株流行于意大利北部(1999～2003年)的H7N1亞型禽流感病毒，對其NS1基因進行研究，結果發現，編碼全長(230 aa)的毒株數量共計16株，C-端缺失編碼(220 aa)的毒株數量共計6株，其余18株毒株間斷性缺失編碼(224 aa)，且C端間隔性缺失的均具有較強的致病性。流行初期，致病性偏低的毒株均具有完整的NS1基因序列，后逐漸開始缺失。

2NS1蛋白的結構

NS1蛋白被分為RNA結合區和效應區(即RBD和ED)2個重要的功能區。第1～73位aa為RNA結合區，其中第19～38位aa是核心區，能與異源RNA結合[5]。RNA結合區由3個α螺旋(分別是第1～30位aa，第30～50位aa，第50～73位aa)構成，它們之間通過環相連，第二個螺旋中的R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位點，對NS1蛋白和dsRNA結合具有重要作用[6-7]，第一個NS1全長結構是將這2個功能性位點突變為丙氨酸后結晶解析出來的。從第74位aa開始至羧基端為NS1的效應區，效應區的功能包括阻斷宿主mRNA的剪接、逐漸酸化多聚腺苷、抑制核轉運等[8]。此外，第34～44位aa和第203～237位aa是2個核定位信號區(NLS)。第34～44位aa相對較為保守，序列為Asp-Arg-Leu-Arg-Arg，而后者僅發現在部分病毒株中。

2.1RNA結合域通過對PDB晶體結構數據庫進行檢索，找到了6條A型流感病毒NS1蛋白的RBD晶體結構。對其PDB ID進行統計，結果為：1NS1、1AIL、2ZKO、2ZOA、3F5T、3M8A。采用DiscoveryStudio2.1軟件對上述RBD單體結構進行分析，結果發現，二級結構均具有相同的折疊方式，僅loop區及少數氨基酸側鏈稍有差別。RBD單體結構均由3個α-螺旋組成，分別為α1、α2、α3(分別是第1～30位aa，第30～50位aa，第50～73位aa)，螺旋之間由loop區連接[9]。RBD結構見圖1[10]。通過結構分析，RBD結構域是一個對稱的同源二聚體，該二聚體結構在不同毒株之間高度保守，6個螺旋的同源二聚體來識別dsRNA[10-11]，其中R38位和K41位是NS1蛋白的功能性位點，對RBD的RNA結合至關重要。RBD與dsRNA復合物晶體結構(PDB ID：2ZKO)見圖2，二聚體和dsRNA結合比是1∶1，已經解析出NS1 RBD與dsRNA的相互作用模式：RBD表面有一個較深的口袋，2個反向平行的a-螺旋a1、a1′形成口袋的底面，實現對dsRNA的結合，四壁由反向平行a-螺旋a2、a2′形成。

圖1　RBD的晶體結構Fig.1　Crystal structure of RBD

圖2　RBD和RNA復合物的晶體結構Fig.2　Crystal structures of RBD and RNA compound

在NS1-RBD中，有關RNA結合功能尚未明確。較為一致的觀點是：RBD、dsRNA兩者間的結合能夠對dsRNA起到一定的隔離作用，這阻礙了dsRNA和其他細胞內能夠激活I型干擾素蛋白的相互作用，最終使得宿主細胞不能產生β-干擾素，從而拮抗了宿主細胞的抗病毒反應。NS1蛋白的功能依賴于其結合的RNA類型：與成熟細胞mRNA的3′-poly(A)結合時，可抑制其mRNA核輸出[12]；與雙鏈RNA(dsRNA)結合時，通過間接阻止α/β干擾素的生成來降低宿主細胞的抗病毒能力；與U6snRNA、U6atacsnRNA的結合，對前體mRNA的剪輯進行抑制[13-14]；另外，NS1與病毒RNA結合后，再與結合ED的eIF4GI進行聯合，極大地提高了病毒的翻譯水平。

2.2效應區結構通過對PDB晶體結構數據庫進行檢索，找到了9條A型流感病毒NS1蛋白的ED晶體結構。對其PDB ID進行統計，結果為2KKZ；3EE8；3EE9；3D6R；2RHK；2GX9；3F5T；2RHK；3KWI。采用DiscoveryStudio2.1軟件對上述RBD單體結構進行分析，結果發現，除在loop區以及羧基端末尾處有所不同外，二級結構幾乎相同[15-17]。晶體學研究顯示，效應區都可以獨立地進行二聚化，每個單體由7個β-鏈和3個α-螺旋組成。效應區還包含多個蛋白結合位點，如延伸起始因子(簡稱eIF4GI)，雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(簡稱PKR)，多聚腺苷酸結合蛋白II(簡稱PAB II)，切割多聚腺苷酸的特異性因子30 kD亞基(簡稱CPSF30)等，反映了NS1具有多功能蛋白的特性。目前只有NS1-CPSF30復合物的晶體結構，NS1與其他蛋白的相互作用機制研究尚不明確。此外，ED對NS1二聚體的形成和穩定有一定作用[16]。

2.3NS1蛋白全長晶體結構2008年Bornholdt等[15]報道了A型禽流感病毒株H5N1(A/Vietnam/1203/2004) NS1蛋白全長的晶體結構，其PDB IDW為3F5T，為NS1全長晶體結構的首次報道。該晶體結構通過X-射線晶體衍射法測定(圖3)[15]。

圖3　H5N1非結構蛋白NS1 X-衍射晶體結構Fig.3　X-ray diffraction crystal structure of non-structural protein NS1

研究認為，晶體中ED、RBD 2種單體的結構，與已經解析到的單體結構大體相同。RBD的結構與已報道的單個功能域的二聚體結構無明顯區別，各個部分都參與二聚體相互作用。但ED結構域中，由于3個β-折疊的整體平移，致使 ED的作用界面發生變化。研究發現，在全長NS1蛋白晶體中，鎖鏈二聚體是一個NS1單體的RBD和ED分別與另一個單體的RBD和ED相互作用產生，而不是2個單體簡單的聚集。基于此，研究者認為，NS1蛋白分子形成長鏈二聚體的方式是交互式結合，每3條NS1長鏈二聚體又形成一個螺旋狀管狀寡聚。所有已知的效應區配體結合位點全部暴露在寡聚體外表面，結合dsRNA的關鍵氨基酸位于中心通道的表面[12]。

3非結構蛋白NS1的功能

作為典型的多功能蛋白，NS1具有較強的調節活性，能夠對流感病毒的致病性、毒力等起到相應的調節作用。人體感染病毒初期，便可監測到較多的NS1蛋白；該蛋白被磷酸化后，可調節病毒的復制過程，S42、T49、T215是主要的磷酸化位點。NS1蛋白的功能主要體現在2個方面：①從宿主方面間接進行抗病毒反應，如抑制宿主細胞的合成、下調細胞凋亡及阻礙干擾素的生成等；②通過促進自身mRNA的翻譯，使病毒復制進程不斷加快，直接提升流感病毒的致病力[18]。

3.1抑制宿主蛋白的合成在真核細胞的基因表達過程中，RNA的轉錄后修飾和其于細胞質核中的轉運這2個環節極其重要，因此，當病毒作用于細胞的轉錄后加工過程時，細胞功能會受到嚴重干擾。在宿主蛋白相應的合成過程中，NS1蛋白通過以下途徑達到抑制目的：①對宿主細胞mRNA的核輸出起到抑制作用；通過結合小核RNA，對前mRNA的剪接進程進行阻斷[19-20]，最終對細胞蛋白合成起到阻礙作用[21]。②NS1蛋白可以和宿主體內的其他受體蛋白發生作用，對基因轉錄、轉錄后的加工、翻譯等過程進行干擾，從而干擾宿主蛋白的表達，影響細胞的正常生理功能。研究表明，NS1蛋白能夠分別與Poly(A)結合蛋白Ⅱ、NS1結合蛋白發生作用，影響宿主蛋白pre-mRNA 3′端的剪切、多聚腺苷酸化和mRNA的核轉運等過程，最終對宿主蛋白的正常合成起到抑制作用[22-24]。

3.2下調細胞凋亡細胞凋亡(Apoptosis)，即為使人體內環境保持穩定，由基因控制的細胞自主的、有序的死亡，它不是一個病理過程，而是生物體為實現自身的穩定、平衡或防御外部影響等作出的選擇。根據細胞的凋亡機制，生物體將不需要的細胞予以清除，而不會產生炎癥反應。研究發現，NS1蛋白可能是通過抑制PKR-IFN途徑和PI3K激活途徑來下調細胞凋亡。Zhirnov等[25]抽取2種不同類型的毒株(一種為野生型：流感病毒株；一種為突變型：NS1基因缺失)對其在細胞凋亡階段所起到的誘導作用進行比較，結果表明，突變型毒株可以對合成干擾素(簡稱IFN)的細胞凋亡起到促進作用，但對于不能合成IFN的細胞，2種類型的毒株無顯著差異。基于此，研究者認為流感病毒中的NS1蛋白有依賴于IFN的抗細胞凋亡作用。同時研究顯示，NS1蛋白能夠上調細胞凋亡閾值，使被感染細胞的凋亡推遲。另外，通過PI3K激活途徑NS1蛋白也可調節細胞的凋亡。Ehrhard等[26]認為，NS1蛋白能夠與PI3K結合并將其激活。通過諸多的級聯反應，對感染細胞的凋亡過程進行抑制，病毒自身得以有效復制。

3.3拮抗干擾素的產生病毒感染細胞后可抑制干擾素的合成。機體產生2種類型的干擾素：INF-α/β、INF-γ。干擾素-α/β(IFN-α/β)在機體抗病毒過程中發揮重要功能，是宿主進行抗病毒感染的第一道防線。NS1蛋白能夠利用不同的機制對IFN-α/β的產生和釋放產生抑制作用。該類機制包括對抗病毒活性的PKR、2′-5′合成酶(2′-5′oligoadenylate synthetase)的激活和干擾素調節因子激活等過程進行抑制；阻止dsRNA活化的抗病毒信號轉導通路等[27-28]。這些都與NS1蛋白的RNA結合區有很大關系。研究發現，在能產生干擾素的細胞內，NS1基因缺失的病毒無法進行有效復制；而在不能產生干擾素的細胞內，病毒可以有效增殖。由此可知，在流感病毒的復制過程中，NS1蛋白拮抗宿主細胞干擾素的產生[29]。

3.4NS1蛋白與宿主蛋白相互作用NS1蛋白在細胞內與宿主蛋白相互作用，通過增強病毒自身蛋白的表達、重新分布宿主蛋白等，增強病毒的毒力和致病性。宿主蛋白主要包括Staufen蛋白、NS1結合因子、Poly(A)結合蛋白等[17]。Falcon等[30]研究表明，NS1蛋白和Staufen蛋白的特異性結合，促進了病毒mRNA的定位，加快了病毒蛋白的有效合成。Wolff等[31]研究表明，NS1蛋白可以和NS1結合因子相互作用，加快病毒的復制過程，拮抗機體的抗病毒反應。

4展望

20世紀以來，流感病毒在全球廣泛流行，不僅嚴重影響經濟、社會的發展，而且對人類健康與生命安全構成嚴重威脅。目前，美國FDA認可和獲批了4種抗流感病毒藥物。按照各自的作用機制，可將其分成兩大類：M2離子通道蛋白抑制劑、NA抑制劑。M2蛋白產生的耐藥株具有致病性和傳染性，且只有A型流感病毒才有M2離子通道蛋白，因此，M2離子通道蛋白抑制劑在臨床上未被廣泛使用。NA抑制劑奧司他韋被認為是目前所發現的特異性最高的藥物，但由于流感病毒抗原的高度變異性，NA作為抗原之一，根據其結構設計出的抗病毒藥物對于新型流感病毒的防治具有局限性。NS1作為流感病毒唯一的非結構蛋白，其功能位點氨基酸的遺傳保守性很強，可將該類功能位點作為靶標，更深入地研究抗流感病毒藥物及其防控技術。對NS1蛋白的結構、功能進行深入研究，將為流感病毒的預防及治療提供更多的可能性。

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Research Progress of Non-structural Protein NS1 of Influenza A Virus

PAN Peng-ge

(Bioduro (Beijing) Co.，Ltd.，Beijing 102200)

AbstractWe reviewed the evolution，structure and pathogenicity of NS1 protein.Based on this，anti-influenza drugs and their control technologies were forecasted，aiming at providing more possibility for the control and cure of influenza virus.

Key wordsInfluenza A virus; Non-structural protein NS1; Pathogenicity; Function; Structure

作者簡介潘朋歌(1987- )，女，河南洛陽人，碩士，從事分子生物學研究。

收稿日期2016-03-16

中圖分類號R 393

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)10-154-03