豬瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表達與鑒定

周景明，劉芳冰，祁艷華，張改平,2，栗 寧，王愛萍*

(1.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 450001；2.河南農業大學,河南鄭州 450002)

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豬瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表達與鑒定

周景明1，劉芳冰1，祁艷華1，張改平1,2，栗 寧1，王愛萍1*

(1.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 450001；2.河南農業大學,河南鄭州 450002)

摘要[目的]研究豬瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15細胞中的表達特性。[方法]通過PCR方法克隆了E0基因全長681 bp的片段，連接到真核表達載體pEGFP-C1上，構建出重組質粒并進行雙酶切鑒定。[結果]成功構建出重組質粒pEGFP-E0。通過雙酶切鑒定，PCR鑒定和測序確定了目的基因大小一致，插入位置完全正確后，利用Lipofecta mine 2000轉染試劑盒將重組質粒轉染到豬腎細胞PK-15中，轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察，可以看到大多數細胞呈現出綠色熒光，說明轉染成功。通過G418篩選后，在熒光顯微鏡下仍能觀察到部分細胞能夠呈現出綠色熒光，這表明重組融合蛋白pEGFP-E0在PK-15細胞中得到了表達。[結論]獲得的能夠表達重組融合蛋白的細胞克隆，為進一步大量表達與純化E0糖蛋白、制備其單抗以及研究豬瘟病毒E0糖蛋白的生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞豬瘟病毒；E0蛋白；增強型綠色熒光蛋白；PK-15細胞

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性傳染病，臨床上以高熱、皮膚和黏膜出現大量出血點為主要特征[1]。世界動物衛生組織將其列為 A 類傳染病，我國也將其列為一類傳染病。豬瘟病毒是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus),為單股正鏈RNA病毒[2]，其基因組編碼1個多聚蛋白，經宿主細胞和病毒蛋白酶裂解后產生4種結構蛋白(C(p14)、E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55))和7種非結構蛋白(Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[3]。CSFV 自然感染豬后，機體可產生針對結構蛋白E2、E0和非結構蛋白NS2-3的抗體[4]。

E0蛋白是CSFV的一個保護性抗原蛋白，可誘導產生中和抗體，其抗原性與 E2 相比是能誘導機體產生保護性免疫力的第二抗原蛋白。E0蛋白由病毒 ORF中 GLu168-ALa494 組成[5]，有 9 個可能的糖基化位點，糖基化前后的分子質量分別為 25.7 ku 和 44～48 ku[6]。E0是唯一一個可以分泌到豬瘟病毒感染的細胞培養液上清中的糖蛋白[7]。Shen等[8]研究表明 E0可單獨誘導免疫保護，誘導產生的中和抗體可以抵抗大劑量豬瘟病毒的攻擊。利用在昆蟲細胞表達的 E0和 E2進行的抑制試驗表明，E0和 E2 是與不同的細胞表面受體作用，豬瘟病毒最初是通過E0的介導才能結合到細胞上的[9]。另外，在各毒株內編碼 E0的氨基酸序列比編碼 E2 的氨基酸序列要更加保守[10]。因此，E0是防治豬瘟的主要靶蛋白之一。筆者利用豬源性的PK-15細胞作為表達豬瘟病毒E0糖蛋白的表達系統，將豬瘟病毒E0基因在PK-15細胞中進行表達，并進行雙酶切鑒定，旨在為E0病毒的基因工程疫苗的實際生產和應用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與質粒。PK-15細胞來自河南省農業科學院農業部動物免疫學重點實驗室；真核表達載體pEGFP-C1購自北京天恩澤公司，含有目的基因E0片段的pET28a-E0(BL21)菌種由鄭州大學分子免疫學實驗室保存。

1.1.2工具酶及試劑。質粒DNA純化試劑盒，為TaKaRa公司產品；Lipofecta mine 2000試劑盒為invitrogen公司產品；胎牛血清和DMEM培養基，購自Gibco公司；使用的培養基為DMEM(含10%胎牛血清、鏈霉素、青霉素)完全培養基，加入NaHCO3調節pH至7.0 。限制性內切酶Xho1和Kpn1以及T4連接酶，均購自TaKaRa公司。

1.1.3儀器。TP-214分析天平，為美國Denver公司產品； mini-PROTEAN Tetra System電泳儀、GeL DocTMXR+ 凝膠成像系統，為美國Bio-Rad公司產品；NanoDrop 2000c分光光度計、Barnstead Nanopure超純水儀，為美國Thermo公司產品；CMAG HS4加熱磁力攪拌器，為德國IKA公司產品；H1650-W臺式高速離心機，為湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司產品；WD-9405B型水平搖床，為北京市六一儀器廠產品；透析袋MD25，為北京索萊寶科技有限公司產品；IX71倒置式熒光顯微鏡，為日本OLYMPUS公司產品。

1.2方法

1.2.1引物設計。根據GenBank數據庫中公開發表的豬瘟病毒E0序列，利用Primer Premier 5.0設計引物擴增E0序列，預計擴增片段681 bp，設計其上下游引物：上游引物F為5′A CTCGAGCTGAAAATATAACTCAATGGAACCTGAGTGACAACG 3′的5′端含有Xho1酶切位點，下游引物R為5′A GGTACCGGCATAAGCGCCAAACCAGGTTTT 3′的5′端含有Kpn1酶切位點。

1.2.2載體構建。以提取的pET28a-E0基因組DNA為模板，以F/R為引物，擴增E0基因，向50 μL體系中加入ExTaq酶25 μL、引物各0.5 μL、模板1 μL，然后加超輕水補足50 μL，PCR程序為：95 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32個循環；72 ℃延伸7 min。

1.2.3重組質粒的構建。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 產物,并用DNA純化回收試劑盒回收純化681 bp的E0 基因片段,將回收片段進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定條帶是否正確。以Xho1和Kpn1 2個限制性內切酶同時對載體和E0片段進行雙酶切，酶切后產物進行瓊脂糖凝膠電泳電泳并用DNA純化回收試劑盒回收，用T4連接酶進行連接反應，連接條件為4 ℃過夜，將連接產物轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，在含Amp的LB培養基平板上挑取陽性單克隆，對質粒分別進行PCR鑒定、雙酶切鑒定，鑒定成功后送交公司測序。并將成功構建的重組質粒命名為pEGFP-E0。

1.2.4PK-15細胞的轉染。用質粒DNA純化試劑盒純化pEGFP-E0質粒后供轉染用。細胞重懸以后，進行細胞計數，根據12孔板底面積大小，每孔鋪5×105個，鋪4孔，添加DMEM完全培養基補至3 mL，過夜培養至細胞密度90%以上，DMEM不完全培養基沖洗每孔。最后，每孔加入2 mL DMEM，準備轉染液，A液為240 μL DMEM﹢10 μL脂質體2000，B液為230 μL DMEM﹢20 μL(4 μg)質粒，將A液混勻后室溫放置5 min后，再將A液、B液混勻，室溫放置20 min。將轉染液逐滴加入試驗孔中，輕搖。

1.2.5G418篩選。轉染6 h后觀察并記錄熒光情況，并將轉染培養基更換為完全培養基，轉染48 h后更換為G418篩選培養基，通過預試驗確定G418篩選濃度為600 μg/mL。每3～5 d更換1次篩選培養基，以除去死亡細胞和細胞碎片。約21 d后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的熒光情況。

2結果與分析

2.1載體構建PCR擴增產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳，在681 bp左右的位置出現特異性片段，與預期結果一致。將此片段與真核表達載體pEGFP-C1進行雙酶切與連接(圖1)，獲得了重組質粒pEGFP-E0。經Xho1和Kpn1雙酶切，可獲得681 bp左右的特異性片段(圖2)；以pEGFP-E0為模板，以F/R為引物，可擴增出681 bp大小的片段(圖3)。重組質粒經測序鑒定，無氨基酸突變和堿基突變，表明重組載體構建成功。

注：M1.DL2 000 Marker; 1.E0基因的雙酶切產物；2.載體pEGFP-C1雙酶切產物；M2.DL 15 000 Marker.Note:M1.DL2 000 Marker; 1.Double enzyme digestion of E0 gene; 2.Double enzyme digestion of vector pEGFP-C1; M2.DL 15 000 Marker.圖1　將載體pEGFP-C1和質粒E0同時進行雙酶切與連接Fig.1　The double enzyme digestion and connection of pEGFP C1 and E0 plasmid

注： M.DL2000 Marker; 1.重組質粒的雙酶切產物。Note:M.DL2000 Marker; 1.Double enzyme digestion of recombinant plasmid.圖2　重組質粒pEGFP-E0的雙酶切鑒定Fig.2　Double digestion of recombinant plasmid pEGFP - E0

注： M.DL2000 Marker; 1.重組質粒的PCR產物。Note:M.DL2000 Marker; 1.PCR products of recombinant plasmid.圖3　重組質粒pEGFP-E0的PCR鑒定Fig.3The PCR identification of recombinant plasmid pEGFP-E0

圖4　轉染6 h后觀察到的熒光現象(A)、轉染過程的熒光現象(B)和最終篩選出來穩定轉染上重組質粒的PK-15細胞(C)Fig.4　The fluorescence phenomenon after transfection 6 h(A)，fluorescence phenomenon in the process of transfection(B)，final filtered PK 15 cells stable transfected with recombinant plasmid(C)

2.2E0基因表達產物的檢測轉染6 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察到大面積的熒光，后期G418篩選過程中熒光數量在逐步減少，約14 d后對照組細胞全部死亡，約7 d后仍有約10%的細胞有熒光，由此獲得了穩定整合有外源基因的PK-15細胞克隆(圖4)。

3討論

目前應用于蛋白表達的系統大多為原核表達系統(如大腸桿菌類表達系統)，大腸桿菌類原核表達系統雖然較為成熟，但其表達產物以包涵體形式存在，因為缺乏蛋白質加工系統，所以無翻譯后的加工修飾過程，其內源性蛋白酶易降解表達的蛋白質分子且細胞膜間隙含有大量的內毒素。后來，真核表達系統是最具發展前景的蛋白質產生方式，目前研究較多的是酵母和昆蟲細胞表達。酵母和昆蟲細胞表達存在不正確糖基化，并且還有產物復雜不易純化、表達量較低、病毒污染等問題。據報道，單個細胞表達蛋白量達20 pg/d的工程細胞株[11],分批補料式生物反應器懸浮培養細胞密度達2 000萬/mL以上,蛋白產量高達10 g/L[12-13]。 利用豬源性的PK-15細胞作為表達豬瘟病毒E0糖蛋白的表達系統，一方面是為了提高E0蛋白的表達產量，因為PK-15細胞對豬瘟病毒的遺傳密碼子具有嗜好性。另一方面，該系統對E0蛋白的后期加工可以使得該蛋白的反應原性和免疫原性得到很大提高，為將該病毒的基因工程疫苗投入實際生產和應用奠定了基礎。

重組質粒pEGFP-E0穩定轉染PK-15細胞系時，只有部分質粒能夠通過細胞質的阻礙進入到細胞核內，而最多只有80%進入細胞核內的外源DNA能夠得到瞬時表達。只有極少數進入細胞的外援基因在通過一系列非同源分子間重組和連接后整合到細胞染色體中，細胞基因組的自由部分進行表達。此外，在此整合的過程中，并不一定所有整合到細胞染色體的外源基因都能夠表達，因為整合的區段是不同的。只有整合到了表達區段的基因才能夠表達，所以要篩選出能夠穩定表達外源基因的轉染體，篩選的依據為共轉染的編碼抗生素的抗性基因所提供的新表型。

G418是穩定轉染常用的篩選試劑，它是一種氨基糖類抗生素，其結構與慶大霉素、新霉素、卡那霉素相似，它能夠阻斷蛋白質的合成，因此對原核和真核細胞都具有不同的毒性 ,其中包括細菌、植物、酵母、哺乳動物細胞以及一些原生動物和蠕蟲。但是，當pEGFP-C1載體所攜帶的neo抗性基因被整合到細胞基因組正確的位置后，它能夠啟動neo基因編碼的序列轉錄為mRNA,從而使得neo抗性產物——氨基糖苷磷酸轉移酶高效表達，進而將G418轉變成無毒形式，使得細胞獲得足夠的抗性，并且能夠在含有G418的篩選培養基中生長。連續使用篩選培養基篩選14～21 d,在此過程中要及時更換培養基，去除死亡細胞的細胞碎片，以免死細胞產生的有害物質影響正常細胞的生長。約21 d后，就能夠得到穩定表達外源基因的細胞克隆，將此克隆用胰酶消化至培養板中繼續傳代培養，并收集表達的重組蛋白。

由于PK-15細胞本身沒有綠色熒光蛋白基因,將PEGFP和豬瘟病毒E0基因的編碼區相連得到的重組基因可以用來研究基因的表達情況和活細胞內外源基因表達蛋白質的定位。筆者成功地表達了PEGFP-E0融合蛋白,為進一步大量表達和純化E0糖蛋白、制備其單抗以及研究豬瘟病毒E0糖蛋白的生物學功能奠定了基礎。

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Expression and Identification of E0 Protein of Classical Swine Fever Virus in PK-15

ZHOU Jing- ming，LIU Fang-bing，QI Yan-hua，WANG Ai-ping*et al

(School of Life Science，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan 450001)

Abstract[Objective] The aim was to study the characteristic how gene E0 of classical swine fever virus (CSFV) expressed in PK-15.[Method] E0 gene whose full length was 681 bp fragment was cloned by PCR，and then a recombinant plasmid was constructed with eukaryotic expression vector of pEGFP-C1，double enzyme digestion was conducted.[Result] A recombinant plasmid pEGFP-E0 was sucessfully constructed，by restriction enzyme digestion，PCR identification and sequencing，the size of the target gene and insertion position was determined and was right，then recombinant plasmid were transformed into pig kidney-derived cells PK-15 by the Lipofecta mine 2000 transfection kit，after transfection 48h，many cells showed green fluorescence under a fluorescence microscope，which indicated the transfection was successful.After screening by geneticin，there were still green fluorescent cells under the fluorescence microscope，which indicated that the recombinant fusion protein of pEGFP-E0 was expressed in the cell PK-15.[Conclusion] The obtain of expressing recombinant fusion protein of cell clones lay a foundation for further mass production of soluble glycoprotein E0，preparing its monoclonal antibody epitope screening and researching the biological function of protein E0.

Key wordsCSFV; E0 protein; Enhanced green fluorescent protein; PK-15 cell

基金項目國家自然科學基金項目(31172331)。

作者簡介周景明(1972- )，男，河南南陽人，副教授，博士，碩士生導師，從事分子免疫學和免疫學檢測技術研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事分子免疫學研究。

收稿日期2016-03-11

中圖分類號S 852.65+1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)10-160-03