橡膠草高效再生體系的建立和優化

趙李婧， 李永梅， 曹新文， 馬海霞， 閆 潔， 祝建波

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000)

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橡膠草高效再生體系的建立和優化

趙李婧， 李永梅， 曹新文， 馬海霞， 閆 潔*， 祝建波

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000)

摘要[目的]優化橡膠草再生和遺傳轉化體系。[方法]以橡膠草莖和葉為外植體，以1/2MS和MS為基本培養基，研究不同激素濃度配比、外植體類型和激素濃度對橡膠草不定芽誘導和生根的影響。[結果]橡膠草進行組織培養的最佳外植體類型為莖，誘導不定芽形成的最佳激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA。誘導不定芽生根的最佳激素濃度為0.10 mg/L NAA，生根率達100%，移栽成活率達95%以上。[結論]建立了橡膠草高效再生體系，對提高橡膠草組織培養的效率和轉化率具有重要意義。

關鍵詞橡膠草；組織培養；優化

橡膠草(Taraxacumkok-saghyzRodin)為菊科蒲公英屬植物，又稱俄羅斯蒲公英[1-2]，是一種產膠植物，其根中含有約20%的橡膠，其橡膠成分、結構、性能與巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)的橡膠相似。橡膠草作為可以替代橡膠樹的一種植物，由于其生長周期短，具有良好的開發應用前景，是用來研究橡膠樹產膠機理的模式植物。因此，研究橡膠草的再生體系和遺傳轉化體系是深入研究橡膠產膠機理的重要環節。

林伯煌等[3]以橡膠草的莖葉為外植體研究了橡膠草的組織培養，為人工培養橡膠草提供了先例。羅成華等[4-5]研究了橡膠草的離體培養，并建立了高效再生體系，為橡膠草無菌組織培養快速繁殖和遺傳轉化奠定了基礎。羅成華等[6]研究了光質對橡膠草試管苗組織培養的影響，結果發現不同光質對愈傷組織的誘導有促進作用，而利用紅藍混合光對橡膠草外植體進行組織培養，外植體出芽率和叢生芽誘導率均增加，且玻璃化程度顯著降低，移栽成活率提高。筆者分別以橡膠草莖和葉為外植體，對橡膠草再生和遺傳轉化體系進行了優化，對提高橡膠草組織培養的效率和轉化率具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料橡膠草植株于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖邊，后移栽至石河子大學農業科學重點實驗室進行室內培養,培養溫度為(20±3)℃，光照強度為2 000 lx。

1.2培養基基本培養基為MS或1/2MS培養基，向基本培養基中添加不同濃度的瓊脂、蔗糖和植物激素，pH為5.8～6.2,121 ℃高壓滅菌15 min，在超凈工作臺內分裝到培養皿或150 mL三角瓶中備用。

1.3試驗方法

1.3.1不定芽的誘導。將橡膠草莖段剪成2 cm長，將葉剪成1 cm2的大小，將其接種至添加不同濃度植物激素的MS培養基中，設置濃度梯度為0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.05、0.10、0.20 mg/L NAA，30 d后在橡膠草莖和葉片切口的愈傷處長出不定芽。將分化出芽的外植體接種至添加激素的MS培養基上繼續培養。分別設置3個重復，于(20±3) ℃進行培養，觀察不定芽的生長情況，統計不定芽的誘導率。誘導率=(出芽的外植體數/總接種的外植體數)×100%。

1.3.2外植體類型對橡膠草再生的影響。將生長良好的橡膠草無菌苗的莖剪成2 cm長、葉剪成1 cm2的大小，接種至添加1.0 mg/L 6-BA和 0.10 mg/L NAA的培養基中，觀察并統計外植體的誘導率。

1.3.3不定芽生根的誘導。待不定芽長至4～5 cm時，將生長健壯的不定芽置于生根培養基中，培養溫度為(20±3)℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為16～18 h/d。以1/2MS為基本培養基，向其中加入0、0.1、0.3 mg/L的NAA，每個處理接種25個不定芽，每個處理設置3個重復，取平均值，統計不定芽的生根情況，并觀察不同濃度激素對不定芽生根的影響。

1.3.4組培苗的移栽。待根長15 cm左右時，向試管苗加入適量的水，松開封口膜置于栽培室放置1 d，將根系上的培養基洗干凈，移栽至營養土中，營養土和蛭石的比例為3∶1，濕度為用力可以擠出水，25 d后統計成活率。

2結果與分析

2.1不定芽誘導的激素選擇橡膠草不定芽誘導培養基試驗結果表明，在添加不同濃度6-BA和NAA的培養基中，外植體分化時有明顯差異，激素濃度越高，褐化現象和玻璃化程度越明顯。將分化出芽的外植體接種于添加不同濃度6-BA和NAA的MS培養基中繼續培養，發現隨著6-BA濃度的增加，愈傷分化、叢生芽玻璃化和畸形苗形成的現象越嚴重，影響了芽的伸長生長；當NAA濃度較低時芽生長緩慢，且逐漸萎蔫死亡，濃度越高玻璃化程度越高，不利于芽的正常伸長生長。由表1可知，促進不定芽形成的最優水平組合為處理⑤，不定芽的平均誘導率為75.64%，不定芽誘導的最佳激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA(圖1)。

注：A、B、C分別為添加1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA時，15、25和40 d時不定芽的生長情況。Note:A,B,C stands for growth situation of adventitions bud in the 15th,25th and 40th day respectively after adding 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA.圖1　不定芽的誘導Fig.1　Induction of adventitious bud

Table 1Effects of different hormone concentration on adventitions bud regeneration

處理Treatment6-BAmg/LNAAmg/L平均誘導率Averageinductionrate∥%①0.50.057.34②0.50.1015.20③0.50.2017.53④1.00.0539.29⑤1.00.1075.64⑥1.00.2064.43⑦1.50.0553.36⑧1.50.1061.08⑨1.50.2048.52

2.2最佳外植體類型選擇由表2可知，橡膠草葉的平均死亡率約是莖的2倍，莖的平均誘導率約是葉的3倍，達66.03%，因此，選擇橡膠草的莖作為外植體進行后期試驗。

表2外植體類型對橡膠草再生的影響

Table 2The influence of the explant types onTaraxacumkok-saghyzRodin regeneration

外植體類型Explanttypes死亡率Averagemortality∥%誘導率Averageinductionrate∥%葉Leaf27.8322.41莖Stem9.9666.03

2.3不同濃度NAA對不定芽生根的影響將橡膠草不定芽接種到生根培養基(1/2MS)中，結果發現，當培養基中不加NAA時，不定芽生長緩慢，部分生根且根生長緩慢多細密，繼續培養發現組培苗葉開始泛黃，生長狀況不佳(圖2)；向培養基中加入0.1和0.3 mg/L的NAA，生根率高達100%，根壯實且主根明顯，長勢較好；但隨著NAA濃度的增加，莖基部會分化出大塊的愈傷，移栽后成活率較低。因此，選擇最佳誘導生根的激素濃度為0.1 mg/L NAA(表3)。

注：A、B分別為添加0.1 mg/L NAA時，15和40 d的生長情況。Note:A、B stands for the 15th and 40th day growth situation after adding 0.1 mg/L NAA.圖2　不定芽的生根Fig.2　 Adventitious bud rooting

2.4組培苗的移栽當根長15 cm左右時，將練苗1 d的橡膠草無菌苗移栽到濕度適宜的營養土中，待覆膜生長7 d后，發現橡膠草生長狀況良好，移栽后成活率達95%以上(圖3)。

注：A、B均為移栽后40 d的生長情況。Note:A,B is growth situation after transplanting for 40 days.圖3　橡膠草的移栽苗Fig.3　The transplanting of Taraxacum kok-saghyz Rodin

3結論與討論

植物組織離體的分化、脫分化和再分化是一個復雜的變化，此變化受到多種因素的影響，包括植物激素類型、激素濃度、不同激素的濃度配比、外植體類型等。在橡膠草的再生培養中，主要采用的激素為6-BA和NAA[7-10]，外植體主要是地上部分。該研究結果表明，1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA影響橡膠草外植體誘導不定芽，促進外植體從愈傷直接分化出不定芽，0.10 mg/L NAA可以促進不定芽生根，保證無菌苗生長狀態良好。

在橡膠草組織培養過程中，利用之前的誘導培養基在誘導不定芽伸長生長時愈傷分化和玻璃化現象較嚴重，降低了不定芽的質量和誘導率。NAA濃度較高時，不定芽形成的根多以須根為主，無主根，而莖基部常形成大塊的愈傷，在移栽時根易隨著愈傷的破碎而脫落，降低了移栽成活率。

表3　不同濃度NAA對不定芽生根的影響

該試驗結果表明，在橡膠草不定芽誘導形成中，高濃度的6-BA可以促進愈傷的形成，低濃度的NAA有利于不定芽的生長和根的形成。該試驗中，6-BA濃度降低后減小了芽伸長過程中愈傷過度分化對芽生長造成的影響，減少了叢生芽的玻璃化和畸形芽的形成，有效提高了芽的誘導率和質量；低濃度的NAA有利于不定芽的形成。在MS培養基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時，橡膠草不定芽能夠高效、高質量地進行繁殖。高質量的不定芽是生根的重要條件之一，生根時選用健壯、生長良好的不定芽進行誘導生根培養， NAA濃度降低后，誘導不定芽形成了主根，減少了生根過程中莖基部愈傷的形成，提高了移栽成活率。該試驗結果表明，最佳誘導芽生根的激素濃度為0.1 mg/L NAA。

外植體類型的選擇是建立再生體系的另一個重要因素，同一植株的不同器官、同一器官的不同生長時期，其分化和再分化的能力均有差別[11-13]。因此，進行組織培養時，選取合適的外植體是保證組織培養成功的另一個重要因素。該試驗結果表明，以橡膠草的莖作為外植體進行組織培養，分化出的不定芽質量更高，有利于后期不定芽生根的培養，提高移栽成活率。

該試驗結果表明，在調整誘導培養基的激素濃度配比后，橡膠草分化出主根，莖基部愈傷分化明顯減少，因此在煉苗后的移栽過程中發現，此種根的苗移栽成活率達95%以上。

參考文獻

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Establishment and Optimization of High Efficient Regeneration System ofTaraxacumkok-saghyzRodin

ZHAO Li-jing, LI Yong-mei, CAO Xin-wen et al

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

Abstract[Objective] The aim was to optimize Taraxacum kok-saghyz Rodin regeneration and genetic transformation system.[Method] With stems and leaves of T.kok-saghyz as explants, 1/2MS and MS as the basic medium, effects of different hormone concentrations and explant types on adventitious bud induction and rooting were studied.[Result] The results showed that the best explant for tissue culture was stem, the best hormone concentration ratio of adventitious bud induction was 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA, and the adventitions bud was healthy.The most suitable hormone concentration for adventitious bud rooting was 0.10 mg/L NAA with 100% rooting rate and 95% survival rate.[Conclusion] The established high efficient regeneration system of T.kok-saghyz has significance on improving tissue culture efficiency and transformation ratio.

Key wordsTaraxacum kok-saghyz Rodin; Tissue culture; Optimization

基金項目國家自然科學基金項目(31360060)。

作者簡介趙李婧(1989- )，女，山西晉城人，碩士，研究方向：植物基因工程。*通訊作者，副教授，博士，從事生物化學和分子生物學教學和科研工作。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號S 576

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)10-230-02