橡膠草高效再生體系的建立和優(yōu)化

趙李婧， 李永梅， 曹新文， 馬海霞， 閆 潔， 祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

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橡膠草高效再生體系的建立和優(yōu)化

趙李婧， 李永梅， 曹新文， 馬海霞， 閆 潔*， 祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

摘要[目的]優(yōu)化橡膠草再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系。[方法]以橡膠草莖和葉為外植體，以1/2MS和MS為基本培養(yǎng)基，研究不同激素濃度配比、外植體類型和激素濃度對(duì)橡膠草不定芽誘導(dǎo)和生根的影響。[結(jié)果]橡膠草進(jìn)行組織培養(yǎng)的最佳外植體類型為莖，誘導(dǎo)不定芽形成的最佳激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA。誘導(dǎo)不定芽生根的最佳激素濃度為0.10 mg/L NAA，生根率達(dá)100%，移栽成活率達(dá)95%以上。[結(jié)論]建立了橡膠草高效再生體系，對(duì)提高橡膠草組織培養(yǎng)的效率和轉(zhuǎn)化率具有重要意義。

關(guān)鍵詞橡膠草；組織培養(yǎng)；優(yōu)化

橡膠草(Taraxacumkok-saghyzRodin)為菊科蒲公英屬植物，又稱俄羅斯蒲公英[1-2]，是一種產(chǎn)膠植物，其根中含有約20%的橡膠，其橡膠成分、結(jié)構(gòu)、性能與巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)的橡膠相似。橡膠草作為可以替代橡膠樹(shù)的一種植物，由于其生長(zhǎng)周期短，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，是用來(lái)研究橡膠樹(shù)產(chǎn)膠機(jī)理的模式植物。因此，研究橡膠草的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系是深入研究橡膠產(chǎn)膠機(jī)理的重要環(huán)節(jié)。

林伯煌等[3]以橡膠草的莖葉為外植體研究了橡膠草的組織培養(yǎng)，為人工培養(yǎng)橡膠草提供了先例。羅成華等[4-5]研究了橡膠草的離體培養(yǎng)，并建立了高效再生體系，為橡膠草無(wú)菌組織培養(yǎng)快速繁殖和遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。羅成華等[6]研究了光質(zhì)對(duì)橡膠草試管苗組織培養(yǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用，而利用紅藍(lán)混合光對(duì)橡膠草外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，外植體出芽率和叢生芽誘導(dǎo)率均增加，且玻璃化程度顯著降低，移栽成活率提高。筆者分別以橡膠草莖和葉為外植體，對(duì)橡膠草再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)提高橡膠草組織培養(yǎng)的效率和轉(zhuǎn)化率具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料橡膠草植株于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖邊，后移栽至石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(20±3)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx。

1.2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS或1/2MS培養(yǎng)基，向基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的瓊脂、蔗糖和植物激素，pH為5.8～6.2,121 ℃高壓滅菌15 min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)分裝到培養(yǎng)皿或150 mL三角瓶中備用。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1不定芽的誘導(dǎo)。將橡膠草莖段剪成2 cm長(zhǎng)，將葉剪成1 cm2的大小，將其接種至添加不同濃度植物激素的MS培養(yǎng)基中，設(shè)置濃度梯度為0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.05、0.10、0.20 mg/L NAA，30 d后在橡膠草莖和葉片切口的愈傷處長(zhǎng)出不定芽。將分化出芽的外植體接種至添加激素的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，于(20±3) ℃進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不定芽的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=(出芽的外植體數(shù)/總接種的外植體數(shù))×100%。

1.3.2外植體類型對(duì)橡膠草再生的影響。將生長(zhǎng)良好的橡膠草無(wú)菌苗的莖剪成2 cm長(zhǎng)、葉剪成1 cm2的大小，接種至添加1.0 mg/L 6-BA和 0.10 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，觀察并統(tǒng)計(jì)外植體的誘導(dǎo)率。

1.3.3不定芽生根的誘導(dǎo)。待不定芽長(zhǎng)至4～5 cm時(shí)，將生長(zhǎng)健壯的不定芽置于生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為(20±3)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為16～18 h/d。以1/2MS為基本培養(yǎng)基，向其中加入0、0.1、0.3 mg/L的NAA，每個(gè)處理接種25個(gè)不定芽，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值，統(tǒng)計(jì)不定芽的生根情況，并觀察不同濃度激素對(duì)不定芽生根的影響。

1.3.4組培苗的移栽。待根長(zhǎng)15 cm左右時(shí)，向試管苗加入適量的水，松開(kāi)封口膜置于栽培室放置1 d，將根系上的培養(yǎng)基洗干凈，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，營(yíng)養(yǎng)土和蛭石的比例為3∶1，濕度為用力可以擠出水，25 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不定芽誘導(dǎo)的激素選擇橡膠草不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果表明，在添加不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，外植體分化時(shí)有明顯差異，激素濃度越高，褐化現(xiàn)象和玻璃化程度越明顯。將分化出芽的外植體接種于添加不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著6-BA濃度的增加，愈傷分化、叢生芽玻璃化和畸形苗形成的現(xiàn)象越嚴(yán)重，影響了芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)；當(dāng)NAA濃度較低時(shí)芽生長(zhǎng)緩慢，且逐漸萎蔫死亡，濃度越高玻璃化程度越高，不利于芽的正常伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。由表1可知，促進(jìn)不定芽形成的最優(yōu)水平組合為處理⑤，不定芽的平均誘導(dǎo)率為75.64%，不定芽誘導(dǎo)的最佳激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA(圖1)。

注：A、B、C分別為添加1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA時(shí)，15、25和40 d時(shí)不定芽的生長(zhǎng)情況。Note:A,B,C stands for growth situation of adventitions bud in the 15th,25th and 40th day respectively after adding 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA.圖1　不定芽的誘導(dǎo)Fig.1　Induction of adventitious bud

Table 1Effects of different hormone concentration on adventitions bud regeneration

處理Treatment6-BAmg/LNAAmg/L平均誘導(dǎo)率Averageinductionrate∥%①0.50.057.34②0.50.1015.20③0.50.2017.53④1.00.0539.29⑤1.00.1075.64⑥1.00.2064.43⑦1.50.0553.36⑧1.50.1061.08⑨1.50.2048.52

2.2最佳外植體類型選擇由表2可知，橡膠草葉的平均死亡率約是莖的2倍，莖的平均誘導(dǎo)率約是葉的3倍，達(dá)66.03%，因此，選擇橡膠草的莖作為外植體進(jìn)行后期試驗(yàn)。

表2外植體類型對(duì)橡膠草再生的影響

Table 2The influence of the explant types onTaraxacumkok-saghyzRodin regeneration

外植體類型Explanttypes死亡率Averagemortality∥%誘導(dǎo)率Averageinductionrate∥%葉Leaf27.8322.41莖Stem9.9666.03

2.3不同濃度NAA對(duì)不定芽生根的影響將橡膠草不定芽接種到生根培養(yǎng)基(1/2MS)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中不加NAA時(shí)，不定芽生長(zhǎng)緩慢，部分生根且根生長(zhǎng)緩慢多細(xì)密，繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)組培苗葉開(kāi)始泛黃，生長(zhǎng)狀況不佳(圖2)；向培養(yǎng)基中加入0.1和0.3 mg/L的NAA，生根率高達(dá)100%，根壯實(shí)且主根明顯，長(zhǎng)勢(shì)較好；但隨著NAA濃度的增加，莖基部會(huì)分化出大塊的愈傷，移栽后成活率較低。因此，選擇最佳誘導(dǎo)生根的激素濃度為0.1 mg/L NAA(表3)。

注：A、B分別為添加0.1 mg/L NAA時(shí)，15和40 d的生長(zhǎng)情況。Note:A、B stands for the 15th and 40th day growth situation after adding 0.1 mg/L NAA.圖2　不定芽的生根Fig.2　 Adventitious bud rooting

2.4組培苗的移栽當(dāng)根長(zhǎng)15 cm左右時(shí)，將練苗1 d的橡膠草無(wú)菌苗移栽到濕度適宜的營(yíng)養(yǎng)土中，待覆膜生長(zhǎng)7 d后，發(fā)現(xiàn)橡膠草生長(zhǎng)狀況良好，移栽后成活率達(dá)95%以上(圖3)。

注：A、B均為移栽后40 d的生長(zhǎng)情況。Note:A,B is growth situation after transplanting for 40 days.圖3　橡膠草的移栽苗Fig.3　The transplanting of Taraxacum kok-saghyz Rodin

3結(jié)論與討論

植物組織離體的分化、脫分化和再分化是一個(gè)復(fù)雜的變化，此變化受到多種因素的影響，包括植物激素類型、激素濃度、不同激素的濃度配比、外植體類型等。在橡膠草的再生培養(yǎng)中，主要采用的激素為6-BA和NAA[7-10]，外植體主要是地上部分。該研究結(jié)果表明，1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA影響橡膠草外植體誘導(dǎo)不定芽，促進(jìn)外植體從愈傷直接分化出不定芽，0.10 mg/L NAA可以促進(jìn)不定芽生根，保證無(wú)菌苗生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

在橡膠草組織培養(yǎng)過(guò)程中，利用之前的誘導(dǎo)培養(yǎng)基在誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)愈傷分化和玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重，降低了不定芽的質(zhì)量和誘導(dǎo)率。NAA濃度較高時(shí)，不定芽形成的根多以須根為主，無(wú)主根，而莖基部常形成大塊的愈傷，在移栽時(shí)根易隨著愈傷的破碎而脫落，降低了移栽成活率。

表3　不同濃度NAA對(duì)不定芽生根的影響

該試驗(yàn)結(jié)果表明，在橡膠草不定芽誘導(dǎo)形成中，高濃度的6-BA可以促進(jìn)愈傷的形成，低濃度的NAA有利于不定芽的生長(zhǎng)和根的形成。該試驗(yàn)中，6-BA濃度降低后減小了芽伸長(zhǎng)過(guò)程中愈傷過(guò)度分化對(duì)芽生長(zhǎng)造成的影響，減少了叢生芽的玻璃化和畸形芽的形成，有效提高了芽的誘導(dǎo)率和質(zhì)量；低濃度的NAA有利于不定芽的形成。在MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時(shí)，橡膠草不定芽能夠高效、高質(zhì)量地進(jìn)行繁殖。高質(zhì)量的不定芽是生根的重要條件之一，生根時(shí)選用健壯、生長(zhǎng)良好的不定芽進(jìn)行誘導(dǎo)生根培養(yǎng)， NAA濃度降低后，誘導(dǎo)不定芽形成了主根，減少了生根過(guò)程中莖基部愈傷的形成，提高了移栽成活率。該試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)芽生根的激素濃度為0.1 mg/L NAA。

外植體類型的選擇是建立再生體系的另一個(gè)重要因素，同一植株的不同器官、同一器官的不同生長(zhǎng)時(shí)期，其分化和再分化的能力均有差別[11-13]。因此，進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，選取合適的外植體是保證組織培養(yǎng)成功的另一個(gè)重要因素。該試驗(yàn)結(jié)果表明，以橡膠草的莖作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，分化出的不定芽質(zhì)量更高，有利于后期不定芽生根的培養(yǎng)，提高移栽成活率。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，在調(diào)整誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素濃度配比后，橡膠草分化出主根，莖基部愈傷分化明顯減少，因此在煉苗后的移栽過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，此種根的苗移栽成活率達(dá)95%以上。

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Establishment and Optimization of High Efficient Regeneration System ofTaraxacumkok-saghyzRodin

ZHAO Li-jing, LI Yong-mei, CAO Xin-wen et al

(College of Life Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

Abstract[Objective] The aim was to optimize Taraxacum kok-saghyz Rodin regeneration and genetic transformation system.[Method] With stems and leaves of T.kok-saghyz as explants, 1/2MS and MS as the basic medium, effects of different hormone concentrations and explant types on adventitious bud induction and rooting were studied.[Result] The results showed that the best explant for tissue culture was stem, the best hormone concentration ratio of adventitious bud induction was 1.0 mg/L 6-BA and 0.10 mg/L NAA, and the adventitions bud was healthy.The most suitable hormone concentration for adventitious bud rooting was 0.10 mg/L NAA with 100% rooting rate and 95% survival rate.[Conclusion] The established high efficient regeneration system of T.kok-saghyz has significance on improving tissue culture efficiency and transformation ratio.

Key wordsTaraxacum kok-saghyz Rodin; Tissue culture; Optimization

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360060)。

作者簡(jiǎn)介趙李婧(1989- )，女，山西晉城人，碩士，研究方向：植物基因工程。*通訊作者，副教授，博士，從事生物化學(xué)和分子生物學(xué)教學(xué)和科研工作。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號(hào)S 576

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)10-230-02