綠木霉ZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表達

胡　僑，羅　偉，阮　濤，侯亞利，黃　皓，楊忠華

(武漢科技大學化學工程與技術學院， 湖北 武漢，430081)

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綠木霉ZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表達

胡僑，羅偉，阮濤，侯亞利，黃皓，楊忠華

(武漢科技大學化學工程與技術學院， 湖北 武漢，430081)

摘要：以前期篩選到的纖維素酶高產菌株綠木霉T.viride ZY-01的總RNA為模板，利用RT-PCR技術克隆出內切葡聚糖酶EGⅣ基因，連接至pET-28a構建出重組質粒，并轉化至E.coli BL21(DE3)中表達。該EGⅣ基因約有1089 bp，在啟動子T7lac的控制和IPTG的誘導下，目的基因成功地在原核細胞中表達。通過SDS-PAGE檢測得出目標蛋白分子量為39 kDa，重組酶的比酶活為1.05 U/mg，該酶最適pH值為6、最適反應溫度為50 ℃。

關鍵詞：綠色木霉；纖維素酶；內切葡聚糖酶；EGⅣ基因；基因重組；原核表達

纖維素是自然界中最豐富、最廉價的有機可再生資源，而纖維素酶是生物轉化纖維素過程中的一類復合酶，主要由內切葡聚糖酶EG、外切葡聚糖酶CBH和β-葡糖苷酶BG等組成，其中，EG酶主要作用于纖維素內部的非結晶區，能隨機地在纖維素分子內部降解β-1,4糖苷鍵，使長鏈纖維素分子分解成大量含非還原性末端的小分子纖維素。由于EG酶在降解纖維素的過程中起著至關重要的作用，因此對其基因克隆和表達的研究成果有不少，其中部分是在酵母表達系統中表達[1-3]，但酵母表達系統較復雜，并且存在表達量較低等問題，而原核表達系統有很多優點，如遺傳圖譜明確、遺傳背景清楚、菌株培養操作簡單且周期短成本低、能大量獲得基因表達產物等，所以，研究EG酶在原核系統中的高效表達具有重要的意義。

隨著基因工程技術的發展，近年來研究人員已從細菌和真菌(包括里氏木霉、康氏木霉和瑞氏木霉等)中克隆到80多種纖維素酶的相關基因，這些種屬中的大多數基因均在大腸桿菌(E.coli)中得到表達[4-5]。同時，綠色木霉中的CBHⅠ、EGⅢ、EGⅠ等基因也已被克隆出來并在E.coli中表達[6-7]，但綠色木霉EGⅣ基因目前只在家蠶體內表達過[8-9]。為此，本文擬采用逆轉錄和聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法從本實驗室前期篩選出的綠木霉T.virideZY-01中克隆EGⅣ基因，并將其轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行原核表達，從而為構建高效纖維素酶工程菌株提供技術基礎。

1實驗材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株及質粒

綠木霉T.virideZY-01為本實驗室篩選并保存，該菌已被中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC No：M 2012205。宿主菌E.coliDH5α和E.coliBL2l(DE3)、表達載體pET-28a均為本實驗室保存。

1.1.2主要試劑

RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒、質粒快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker均購自TIANGEN公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Fermentas公司；限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ購自NEB公司。

1.1.3主要培養基

LB培養基主要用于篩選轉化子并誘導重組菌在大腸桿菌中的表達。察氏培養基主要用于培養T.virideZY-01，按GB/T 4789.28—2003配制。

1.2實驗方法

1.2.1T.viride ZY-01的培養

綠木霉T.virideZY-01在察氏固體培養基上劃線，在30 ℃的霉菌培養箱中培養2～3 d后，待長出大量單一、均勻的綠色孢子，用蒸餾水洗滌、抽濾得到孢子，保存于液氮或-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2T.virideZY-01 RNA的提取以及cDNA的合成

在液氮的作用下將備用孢子研磨至粉末狀。根據說明書用RNAprep Pure Plant Kit植物總RNA提取試劑盒提取T.virideZY-01的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總RNA為模板，在逆轉錄酶M-MuLV的作用下，根據RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明合成cDNA，保存于-70 ℃冰箱中，作為PCR擴增的模板。

1.2.3T.virideZY-01纖維素酶EGⅣ基因的克隆

根據GenBank上編號為HM222525.1的同源菌株TrichodermavirideAS3.3711 EGⅣ的mRNA序列，利用Primer Premier 5軟件設計引物，根據序列特點以及pET-28a上的酶切位點，添加相應的酶切位點及保護性堿基，委托北京擎科新業生物技術有限公司合成引物，引物序列為：

正向: 5′-CCCA/AGCTTATGATCCAGAAACTGTCTAACC-3′(HindⅢ)；

反向：5′-CGCG/GATCCCTAGTTCAGGCACTGAGCGTAG-3′(BamHⅠ)。

以cDNA為模板，PCR擴增出纖維素酶EGⅣ基因，反應條件為：32次擴增循環(95 ℃×5 min，94 ℃×1 min，59 ℃×1 min，72 ℃×1.5 min)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到目的基因。

1.2.4重組質粒pET-28a-EGⅣ的構建

回收擴增得到的PCR產物，同時對表達載體pET-28a和EGⅣ基因用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，膠回收并純化，經T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接后轉化至大腸桿菌E.coliDH5α，在LB/Kan50抗性平板上篩選轉化子，轉化子經菌落PCR和重組質粒雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質粒送至北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.2.5EGⅣ基因在E.coliBL21(DE3)中的誘導表達

測序正確的重組質粒用熱激法轉化至E.coliBL21(DE3)中，挑取陽性重組子至液體LB/Kan50中，37 ℃搖床培養至OD600為0.4～0.6時，降溫至30 ℃，分別加入終濃度為0.4、0.7、1.0 mmol/L的 IPTG，誘導6 h后取10 mL菌液，離心沉淀，用pH值為7.4 的0.2 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌后重懸，超聲波破碎菌體，經4 ℃、10 000g離心后收集上清液和沉淀，分別加入100 μL 1×蛋白上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳檢測,同時與誘導空載體pET-28a轉化至E.coliBL21(DE3)的菌株進行對照。

1.2.6粗酶液的制備及內切葡聚糖酶的酶活力測定

取50 mL大腸桿菌的重組子誘導菌液，于4 ℃、8000g離心2 min收集菌體，用5 mL濃度為0.05 mmol/L的檸檬酸緩沖液(pH=4.8)重懸，超聲破碎菌體，4℃、8000g離心10 min，所得上清液即為粗酶液。制作BSA標準曲線，采用Bradford法對粗酶液中的蛋白含量進行測定。

以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物，用粗酶液將其降解為葡萄糖，利用DNS(二硝基水楊酸)法測葡萄糖的含量，以計算內切葡聚糖酶的酶活力。具體方法為：取0.5 mL處理好的粗酶液與1 mL 含0.5% CMC-Na的檸檬酸緩沖液(pH=4.8)在50 ℃反應1 h，加入0.5 mL DNS終止反應，沸水浴5 min后迅速冰水浴至室溫，加4 mL蒸餾水，混勻，用紫外分光光度計測出OD540值。在本實驗條件下每分鐘由底物產生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

2實驗結果

2.1T.virideZY-01中纖維素酶EGⅣ基因的克隆

經察氏培養基培養得到的生長狀態最佳的T.virideZY-01綠色孢子如圖1所示，從中提取的總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。由圖2可見，T.virideZY-01總RNA中28S和18S的條帶亮度比為2∶1，且條帶非常整齊，無拖帶現象，表明RNA是完整的；通過測量得出OD260/OD280的值為2.0，表明RNA的純度較高，沒有發生降解。

RT-PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3所示。圖3顯示PCR產物的大小約為1100 bp。將目的基因純化后進行測序，結果表明EGⅣ基因開放閱讀框長度為1089 bp，編碼344個氨基酸，計算得到蛋白分子量為39 kDa。所得基因序列與GenBank上編號為 HM222525的序列相比，堿基相似度為91.3%，氨基酸序列相似度高達100%。

圖1　T. viride ZY-01綠色孢子

Lane 1：DNA Marker;Lane 2：總RNA

Fig.2 Electrophoretogram of total RNA fromT.virideZY-01

Lane 1: 100 bp DNA Ladder;

Fig.3 Electrophoretogram of RT-PCR amplification products

2.2重組質粒的構建及鑒定

按1.2.4節的方法構建重組質粒，挑取轉化子至含Kan抗性的LB培養基中培養，提取重組質粒，利用BamHⅠ和HindⅢ進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4，圖中顯示獲得了5300 bp和1100 bp的目的片段，表明質粒構建成功并成功轉化至大腸桿菌中。

Lane 1：Marker Ⅲ；

Fig.4 Electrophoretogram of recombinant plasmid pET28a-EGⅣ by double enzyme digestion

2.3重組酶的誘導表達及酶活力測定

分別取不同濃度IPTG下的誘導液，按照1.2.5節的方法處理之后進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖5所示。從圖5中能看到約為39 kDa的目的蛋白，這與利用DNA測序結果進行翻譯后預測的蛋白分子大小相同，說明EGⅣ基因成功地在大腸桿菌中表達。經過檢測計算得到1 L重組菌發酵液的酶活力為49 U，蛋白含量為0.047 g，表達強度為49 U/L發酵液，CMCase比酶活為1.05 U/mg，比野生型綠色木霉T.virideZY-01的CMCase比酶活[10]提高了0.17 U/mg。

Lane M: 蛋白Marker； Lane 1: pET-28a誘導表達產物；

Fig.5 SDS-PAGE result of expression products induced by IPTG

2.4重組酶最適宜的反應溫度和pH值

分別取1 mL粗酶液與1 mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.8)，在25、35、…、95 ℃反應1 h，測取相應條件下EGⅣ重組酶的酶活力，結果如圖6所示。由圖6可以看出，隨著反應溫度從25 ℃升至50 ℃，EGⅣ重組酶的酶活力迅速提高，這是因為溫度升高可加快分子運動的速率、提高分子碰撞概率，從而使反應速率加快；在50 ℃左右時酶活力達到最高值；隨著反應溫度的繼續上升，酶蛋白逐步變性而失活，從而降低酶促反應速率，酶活力逐漸下降。因此，本研究得到的內切葡聚糖酶在50 ℃反應時酶活力達到最高，而野生型綠色木霉T.virideZY-01的纖維素酶最適溫度為60 ℃[10]，兩者存在一定的差異，這是因為重組酶的酶組分比較單一，而野生綠色木霉生產的纖維素酶是一種復合酶。

圖6　不同反應溫度下重組酶的相對酶活

Fig.6 Relative enzyme activity of recombinase at different reaction temperatures

分別取1 mL粗酶液與1 mL含0.5% CMC-Na的檸檬酸鈉緩沖液(pH值在3～12之間變化)，在50 ℃下反應1 h，測取相應條件下EGⅣ重組酶的酶活力，結果如圖7所示。由圖7可以看出，隨著底物pH值從3升至6，底物分子逐步達到解離狀態，酶與底物逐漸結合，使得酶活力不斷上升；當底物pH值為6時，酶活性中心的可解離基團處于最適反應狀態，酶活力達到最高；隨著pH值的繼續升高，酶蛋白變性而失活，酶活力又迅速下降。同樣，重組酶的最適pH值與野生型綠色木霉T.virideZY-01的纖維素酶最適pH值(=5.0)[10]相比有一定的差異，EGⅣ重組酶最適宜的作用環境更接近中性。

圖7　不同pH值下重組酶的相對酶活

Fig.7 Relative enzyme activity of recombinase at different pH values

3討論

綠色木霉是木霉屬中纖維素酶產量較高的菌株，但纖維素酶是復合酶，而且在纖維素酶降解纖維素的過程中，各組分的比例主要由微生物內部的調控機制調節。為了明確各組分的主要作用，只能采用基因工程技術分別將纖維素酶中的相關基因克隆下來并進行表達，對不同酶的活性進行測定，找到降解天然纖維素最合適的纖維素酶成分以及最合適的比例，從而達到高效利用纖維素的目的。

盡管原核表達系統有很多優點，但外源基因在原核細胞中表達速度過快，極容易在細胞質內聚集而形成包涵體，使表達的活性蛋白不可溶且酶活較低，信號肽、內含子、翻譯后的修飾問題、密碼子的偏愛性都有可能導致這種問題的發生。在表達綠木霉的EGⅣ時，考慮到真核基因在大腸桿菌中表達時普遍存在表達量低的問題，本實驗選用了pET-28a作為表達載體。pET系列是利用大腸桿菌T7噬菌體轉錄系統進行表達的載體。T7 lac啟動子是迄今最強的啟動子，它可以最大程度地利用大腸桿菌的資源表達外源蛋白[7]。本表達系統與釀酒酵母表達系統相比，內切葡聚糖酶表達的酶活力偏低，究其原因可能是原核細胞中缺乏真核基因中罕見的密碼子，從而影響了目的蛋白的高效表達，此外，在研究中尚未對表達條件進行優化也是影響酶活力的原因之一。去掉信號肽序列、更換為可溶性表達載體pET-32a、提高表達內切葡聚糖酶活性的實驗還在進一步研究中。

4結語

本研究克隆了實驗室前期篩選的綠木霉T.virideZY-01中的纖維素酶EGⅣ基因，并將其連接至載體pET-28a且轉化至E.coliBL21(DE3)中得到內切葡聚糖酶EGⅣ工程菌株，其39 KDa的目標蛋白成功地在原核細胞中表達，重組酶的CMCase比酶活達到了1.05 U/mg，比野生型T.virideZY-01的CMCase比酶活提高了0.17 U/mg。對重組酶的酶學特性進行研究，得出其最適pH值為6、最適反應溫度為50 ℃。

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[責任編輯尚晶]

Cloning of cellulase EGⅣ gene fromTrichodermavirideZY-01 and its prokaryotic expression inE.coli

HuQiao，LuoWei，RuanTao，HouYali，HuangHao，YangZhonghua

(College of Chemical Engineering and Technology, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China)

Abstract:Endoglucanase Ⅳ (EGⅣ) gene was cloned by using RT-PCR with the total RNA of Trichoderma viride ZY-01, a strain with high cellulase productivity and screened in our previous work，as template. Then the gene was ligated into pET-28a to construct the recombinant plasmid, and transformed into E.coli BL21(DE3) to be expressed. The cloned EGⅣ gene fragment is about 1089 bp. Controlled by promoter T7lac and induced by IPTG, the target gene is successfully expressed in prokaryote. Molecular weight of the target protein is 39 kDa according to SDS-PAGE analysis. Specific enzyme activity of the recombinase is 1.05 U/mg. The optimum pH value and reaction temperature of this enzyme is 6 and 50 ℃, respectively.

Key words：Trichoderma viride; cellulase; endoglucanase; EGⅣ gene; gene recombination; prokaryotic expression

收稿日期：2015-12-11

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21376184).

作者簡介：胡僑(1990-)，女，武漢科技大學碩士生.E-mail: huqiao294873270@163.com通訊作者：楊忠華(1976-)，男，武漢科技大學教授，博士生導師.E-mail: yangzh@wust.edu.cn

中圖分類號：Q786

文獻標志碼：A

文章編號：1674-3644(2016)02-0156-05