肋果沙棘北緣居群的遺傳多樣性與遺傳結構

李　霓， 蔣嚴妃， 蘇　雪， 陳　紋， 張　輝， 孫　坤

( 西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070 )

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肋果沙棘北緣居群的遺傳多樣性與遺傳結構

李霓， 蔣嚴妃， 蘇雪， 陳紋， 張輝， 孫坤*

( 西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070 )

摘要：該研究利用SSR分子標記，對肋果沙棘(Hippophae neurocarpa)分布區北緣青海祁連地區5個自然居群進行分析,旨在了解小地理尺度下肋果沙棘北緣居群的遺傳多樣性和片段化分布居群的遺傳結構，為肋果沙棘居群的資源保護提供了依據。采用6對微衛星引物對107個樣本DNA進行擴增，共檢測到27個等位變異，變幅為2～9個，平均每個位點有4.67個，平均觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.142和0.230，Shannon信息指數(I)的變幅介于0.280～0.567之間，平均值為0.374，說明肋果沙棘北緣居群的遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數Fst=0.483，分子方差分析(AMOVA)表明肋果沙棘有48.33%的變異存在于居群間，51.67%存在于居群內。對5個居群之間的遺傳距離與地理距離做Mental檢驗，結果表明遺傳距離與地理距離相關性不顯著，對基因流檢測發現居群間的Nm為0.328，推測遺傳漂變是居群分化的關鍵因素之一。Structure分析把5個居群分為2組。UPGMA聚類分析表明5個居群聚為2個分支，其中居群ARX為單獨的一支，與主坐標分析的結果一致?；诜植紖^北緣青海祁連肋果沙棘自然居群的遺傳結構分析，建議應盡可能多地保護不同的地方居群。

關鍵詞：肋果沙棘， SSR標記， 邊緣居群， 遺傳多樣性， 遺傳結構

遺傳多樣性和居群遺傳結構是居群生物學的重要內容，對遺傳多樣性的研究不僅可以揭示物種或居群的進化歷史，而且為進一步分析其進化潛力和未來命運及其保護策略提供重要資料(Soltis & Soltis，1991)。空間遺傳結構的形成是植物進化過程和種群動態的關鍵特征(楊愛紅等，2014)，居群遺傳結構上的差異是遺傳多樣性的重要體現，一個物種的進化潛力和抵御不良環境的能力既取決于種內遺傳變異的大小，也有賴于居群的遺傳結構(Grant，1991；Millar & Libby，1991)。

沙棘屬(HippophaeL.)植物為雌雄異株、風媒傳粉的多年生落葉灌木或小喬木，是重要的經濟和水土保持植物，主要分布于青藏高原及其鄰近地區，它是群落演替的先鋒物種，具有重要的生態和經濟價值。肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)是一個分布于青藏高原高海拔地區且分化較晚的類群，在青海、西藏、四川和甘肅4個省份都有分布，生長在海拔2 300～4 200 m的河流沿岸、河灘及溝谷(廉永善，2000；Sun et al，2002)。近年來國內外學者對沙棘屬植物的遺傳多樣性已開展了大量研究工作(Tian et al，2004；Ruan & Li，2005；Chen et al，2008)，但迄今為止對青藏高原東緣特有的肋果沙棘居群遺傳結構和遺傳多樣性仍缺乏了解。邊緣居群一般處于相對惡劣的條件下，對于環境氣候的變化可能更為敏感，在全球氣候變化的大背景下, 對邊緣居群的研究在制定遺傳多樣性保護策略時具有極高的價值(Van Rossum et al，2003)。青海祁連地區是肋果沙棘分布區的北緣，對該區域肋果沙棘不同地方居群遺傳結構和遺傳多樣性進行研究，對于揭示其進化和適應散布機制有重要的意義。本文應用SSR方法對該區域肋果沙棘居群的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究，以期解決以下問題：1.物種分布區北緣小地理尺度下肋果沙棘各居群的遺傳多樣性水平如何？2.作為風媒傳粉的群落演替先鋒物種，片段化分布的肋果沙棘具有什么樣的空間遺傳結構？其結果將為今后進一步探討肋果沙棘的遺傳變異與進化機制提供理論基礎，為肋果沙棘居群的資源保護和利用提供參考依據。

1材料與方法

1.1 樣本的采集和DNA提取

于2012年9月在祁連山南側的青海省祁連縣進行采樣，分別選取5個肋果沙棘地方居群為對象，各居群的名稱、分布、生境和樣本量等見表1。于野外分別采集新鮮葉片并迅速放入硅膠袋中干燥保存，帶回實驗室備用。肋果沙棘的基因組總DNA的提取參考改良的2 × CTAB法(Doyle，1987)。

1.2 微衛星分析

從Wang et al(2008)開發的9對SSR引物和許汀等(2014)合成的13對SSR引物中篩選出6對條帶清晰、重復性好且有明顯多態的引物(表2)。聚合酶鏈式反應在10 μL反應體系中進行，包括： buffer 1 μL，2.5 mmol·L-1MgCl2，15 mmol·L-1dNTPs (2.5 mmol·L-1each)，0.2 μmol·L-1引物，1.5 U Taq DNA聚合酶，DNA模板50 ng，其余用3dH2O補齊。PCR反應條件為94 ℃預變性1.5 min；35個循環：94 ℃變性45 s，退火45 s(退火溫度見表2)，72 ℃延伸1.5 min；循環結束后，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴增產物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，銀染顯色并參照25～500 bp DNA marker讀取擴增片段長度。

1.3 數據統計與分析

采用GENEPOP 4.0(Rousset，2008)軟件檢測位點間是否存在連鎖不平衡。用GenAlEx 6.501軟件(Peakall & Smouse，2012)分析觀測等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和Shannon信息指數 (I) 等遺傳參數， 其中用He和I來估計居群的遺傳多樣性(Nei，1973；Shannon & Weaver，1959)。

表 1　肋果沙棘居群采集信息

表 2　SSR引物序列和退火溫度

對于遺傳結構的分析，利用了Arlequin軟件(Excoffier et al，2005)計算居群之間的遺傳分化系數(Fst)；并通過分子方差分析(AMOVA)估算肋果沙棘不同居群間遺傳變異的分布情況。運用STRUCTURE3.0軟件(Hubisz et al，2009)的貝葉斯聚類法根據每個個體的多位點基因型進行分組。本文研究了5個地方居群，設K=1～8，MCMC重復值設為100 000，burn-in設為1 000，各K值獨立運行20次，用Evanno et al的方法(2005)計算ΔK值，進而對居群遺傳結構進行分析和作圖。另外我們還采用GenAlEx軟件對所有個體進行了主坐標分析(Principal Coordinate Analysis, PCoA)，利用NTSYS-pc(Rohlf, 2000)軟件進行了聚類分析。

2結果與分析

2.1 居群遺傳多樣性

用6對引物對肋果沙棘樣本進行SSR分析，共檢測到27個等位基因，其中最多的為9個(NHTP-27)，最少的為2個(HTI-01)。平均每個引物擴增出的等位變異為4.67個，且兩兩位點間不存在連鎖不平衡，各位點的DNA片段大小介于70～250 bp之間。分布區北緣肋果沙棘5個居群的平均觀測雜合度(Ho)為0.142，平均期望雜合度(He)為0.230，Shannon信息指數(I)為0.374，居群遺傳多樣性水平較為豐富。在5個居群中拱北灣(GBW)居群的遺傳多樣性最高(He=0.324，I=0.567)，日旭村(RXC)的遺傳多樣性最低(He=0.188，I=0.280)，總體多樣性水平為GBW>ARX>BG>XDS>RXC(表3)。

表 3　肋果沙棘居群的遺傳參數

表 4　肋果沙棘各居群間遺傳分化系數

注： *表示P<0.05，**表示P<0.001，無星號表示P>0.05。

Note: *representsP<0.05,**representsP<0.001, absents of asterisk stands forP>0.05.

表 5　肋果沙棘居群的分子變異分析 (AMOVA)

2.2 居群遺傳結構

肋果沙棘兩兩居群間的遺傳分化系數Fst的變幅為0.306～0.655，平均值為0.483，遺傳分化(Fst)在居群間表現為顯著(P<0.001)； 5個居群間的平均遺傳距離為0.414，其中XDS和ARX之間為最大值，GBW和BG之間的值最小 (表4)。居群間的平均基因流為0.328。分子方差分析(AMOVA)表明，青海祁連肋果沙棘居群之間存在顯著性差異(P<0.001)，48.33%的變異存在于居群間，51.76%的變異發生在居群內的個體間(表5)。Mental檢驗結果表明，雖然青海祁連5個肋果沙棘居群的遺傳距離與地理距離有一定的正相關，但相關性不顯著(r=0.330,P=0.170)。

2.3 Structure分析

Structure軟件分析的ΔK峰值出現在K=2，當K=5時，lnP(D)達到最高水平且此時ΔK值也較高。K=2時，分配到第1組的個體主要來自居群GBW和XDS，第2組的來源主要是ARX、RXC和BG；K=5時，5個居群基本上被分配到不同的組中，其中XDS和ARX的全部個體被分至單獨的組，RXC除1個個體外的其他個體也都被分至獨立的一個組，GBW和BG的個體有一部分被分至RXC的組內，其它大部分個體則也被歸到單獨的組內(圖1)。

2.4 聚類分析與主坐標分析

UPGMA聚類分析表明5個居群聚為2個分支，其中居群GBW與BG先聚為一支，后依次與RXC和XDS聚為一支，居群ARX為單獨的一支(圖2)。主坐標分析的結果與UPGMA聚類結果一致(圖3)。

3討論與結論

遺傳多樣性是物種長期進化的產物，它的水平決定了物種適應進化的潛力。沙棘屬植物主要分布于青藏高原及其邊緣地區，作為群落演替的先鋒物種，如中國沙棘、云南沙棘、江孜沙棘等在適應高原不同生境條件的過程中,形成了豐富的遺傳多樣性，Shannon信息指數從0.197到0.410(孫坤等，2004；Tian et al，2004；張輝和蘇雪，2006)。孟麗華等(2008)利用葉綠體DNA對肋果沙棘譜系地理學的研究發現，其單倍型多樣性指數可達0.300。沙棘屬植物較高遺傳多樣性的形成和維持與其雌雄異株、風媒異交的繁育系統特點一致。本研究利用SSR分子標記對肋果沙棘的研究表明，位于其分布區北緣青海祁連地區的居群遺傳多樣性雖然略低于我們對大地理尺度下肋果沙棘遺傳多樣性的研究結果(溫江波，2010)，但仍具有較為豐富的遺傳多樣性，期望雜合度和Shannon信息指數分別為He=0.230，I=0.374。這一結果支持了邊緣居群與核心居群相比也能維持相對高遺傳多樣性的觀點(Eckstein et al，2006；劉軍等，2013)。Van Rossum et al(1997)認為多年生、遠交繁育和長距離的基因散布是邊緣居群遺傳多樣性較高的重要原因。Thomas et al(2001)提出物種分布區邊緣居群遺傳多樣性較高可能與其面臨更大生存壓力，使得居群營養繁殖機會減少有關。肋果沙棘為風媒異交的多年生灌木或小喬木，種子可通過鳥類長距離散布(Lu et al，2005)，這可能是青海祁連地區肋果沙棘居群遺傳多樣性較高的原因。另外，在分析的5個居群中，GBW居群的遺傳多樣性最高，其原因可能與該居群分布范圍大、個體數量多，且與中國沙棘混生，種間可能存在基因漸滲等有關。

圖 1　對遺傳結構的Structure分析結果Fig. 1　Result of structure analysis on genetic structure

圖 2　肋果沙棘5個居群的UPGMA聚類分析Fig. 2　UPGMA clustering for 5 populations of H. neurocarpa

圖 3　肋果沙棘5個居群107個個體的主坐標分析 (PCoA)　Coord. 1和Coord. 2分別代表39.33%和17.26%的整體遺傳變異。居群代號同表1。Fig. 3　Principle coordinate (PCoA) plot for the 107 individuals from 5 populations of H. neurocarpa　Coord. 1 and Coord. 2 account for 39.33% and 17.26% of total genetic variation, respectively. Population codes see Table 1.

植物居群的遺傳結構受到多個內外因素影響，其中繁育系統、基因流、演替階段等顯著影響了居群的遺傳分化，是影響遺傳結構的最重要因素(葛頌，1994)。而“核心-邊緣假說”認為與核心居群相比，邊緣居群較小，在遺傳漂變和選擇壓力下,其遺傳分化會增大(Hampe & Petit，2005)。本研究中，青海祁連地區的肋果沙棘自然居群有很高程度的遺傳分化(Fst=0.483)，AMOVA結果表明居群間的變異占總變異的48.33%。從Structure分析可以看出，各居群間的分化較為明顯。風媒植物遺傳變異大部分存在于居群內，居群間的分化往往很小，但風媒傳粉的肋果沙棘卻存在有很高的居群間遺傳分化(文亞峰和韓文軍，2010)。我們以前的研究發現，肋果沙棘雖然為風媒傳粉，但其花粉的最遠傳播距離僅為125 m(張玉娜，2009)，而在青海祁連地區肋果沙棘呈片段化分布，居群之間地理距離都遠大于花粉傳播的有效距離，通過花粉傳播基本無法進行居群間的基因交流。對基因流檢測發現居群間的Nm僅為0.328，小于1，遠低于風媒，異交植物的平均基因流水平，不足以抵制居群內遺傳漂變引起的分化。此外，克隆繁殖也會使肋果沙棘各個居群間的遺傳分化加劇。

肋果沙棘作為青藏高原的特有種、群落建群種和演替先鋒物種，具有重要的生態和經濟價值。由于肋果沙棘較豐富的居群內遺傳多樣性和顯著的居群間遺傳分化，在肋果沙棘利用和保護中，應盡可能多地保護不同的地方居群，才能最大限度地保存肋果沙棘的遺傳多樣性。

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Genetic diversity and genetic structure of the northern margin populations ofHippophaeneurocarpa

LI Ni, JIANG Yan-Fei, SU Xue, CHEN Wen, ZHANG Hui, SUN Kun*

(CollegeofLifeSciences,NorthwestNormalUniversity, Lanzhou 730070, China )

Abstract:We analyzed five natural populations of Hippophae neurocarpa in the Qilian area of Qinghai Province with SSR molecular markers, in order to understand the genetic diversity of the northern margin populations of H. neurocarpa on the small geographic scales and the genetic structure of the populations which distribute fragmentally, and to provide reference for resource protection of H. neurocarpa populations. We used six microsatellite primers to amplify the DNA of 107 samples and detected 27 alleles, with the range of 2-9 and a mean value of 4.67 per locus. The average observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity (He) of H. neurocarpa populations was 0.142 and 0.230 respectively, and the range Shannon information index (I) was between 0.280-0.567 with a average value of 0.374. The results showed that the genetic diversity of the northern margin populations of H. neurocarpa was abundant. The coefficient of genetic differentiation (Fst) was 0.483. Molecular variance analysis (AMOVA) indicated that 48.33% of the variation existed among the populations, and 51.67% existed within the populations. No significant correlation between genetic distance and geographic distance was detected by Mental test and the detection of gene flow found that Nm was only 0.328 among populations. These results suggested that genetic drift was one of the key factors for the differentiation of populations. The 5 populations were divided into 2 groups based on the structure analysis. UPGMA clustering showed that the 5 populations were clustered into 2 branches, one of which was ARX, which was consistent with the results of the principal coordinate analysis. According to the analysis of the genetic structure, it is suggested to protect populations in situ as many as possible.

Key words:Hippophae neurocarpa， SSR markers， marginal populations， genetic diversity， genetic structure

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201511006

收稿日期:2015-11-04修回日期： 2016-01-27

基金項目：國家自然科學基金(31160046,31270429) [Supported by the National Natural Science Foundation of China(31160046,31270429)]。

作者簡介：李霓(1991-)，女，碩士研究生，主要從事系統與進化植物學研究，(E-mail)balloonln@163.com。*通訊作者： 孫坤，教授，博士生導師，研究方向為植物系統學、生物多樣性和植物生態學，(E-mail)kunsun@nwnu.edu.cn。

中圖分類號：Q948.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0557-07

李霓，蔣嚴妃，蘇雪，等. 肋果沙棘北緣居群的遺傳多樣性與遺傳結構 [J]. 廣西植物， 2016， 36(5)：557-563

LI N, JIANG YF, SU X， et al. Genetic diversity and genetic structure of the northern margin populations ofHippophaeneurocarpa[J]. Guihaia， 2016， 36(5)：557-563