莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠皮層肝細胞生長因子及血管性血友病因子表達的影響

魏仁平，孫芳玲，劉婷婷，程 華，艾厚喜，郭德玉，田 欣，祝自新，王宇峰，鄭文榮，王 文，3（1.河北北方學院，河北張家口 075000；.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；3.北京市腦重大疾病研究院，北京 100069）

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莫諾苷對腦缺血再灌注大鼠皮層肝細胞生長因子及血管性血友病因子表達的影響

魏仁平1，2，孫芳玲2，劉婷婷2，程 華2，艾厚喜2，郭德玉2，田 欣2，祝自新2，王宇峰2，鄭文榮2，王 文1，2，3
（1.河北北方學院，河北張家口 075000；2.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院實驗動物室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053；3.北京市腦重大疾病研究院，北京 100069）

【摘要】目的 研究莫諾苷對腦缺血再灌注7 d大鼠患側(cè)皮層肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）及血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）表達的影響。方法 25只健康成年雄性Sprague-Dawley （SD）大鼠采用改良Zealonga線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，術(shù)后隨機分為假手術(shù)組、模型組、莫諾苷小劑量組、中劑量組及大劑量組，每組5只。造模后3 h按照30，90，270 mg/ kg劑量每天一次灌胃給予莫諾苷。免疫印跡法和免疫熒光法分別檢測莫諾苷對腦缺血再灌注7 d大鼠患側(cè)皮層HGF及vWF表達的影響。結(jié)果 腦缺血再灌注7 d后，免疫印跡法顯示，與假手術(shù)組相比，模型組HGF蛋白表達顯著升高（P＜0. 01）；同模型組相比，莫諾苷給藥組（30 mg/ kg、90 mg/ kg、270 mg/ kg）HGF蛋白表達水平均顯著升高（P＜0. 05，P＜0. 01，P＜0. 001）。免疫熒光法顯示，與假手術(shù)組相比，模型組vWF表達顯著升高（P＜0. 001）；同模型組相比，莫諾苷中、大劑量組（90 mg/ kg、270 mg/ kg）vWF表達顯著升高（P＜0. 01，P＜0. 001）。結(jié)論 莫諾苷可以上調(diào)HGF及vWF在腦內(nèi)的表達，促進局灶性腦缺血大鼠血管新生。

【關(guān)鍵詞】莫諾苷；腦缺血再灌注；免疫印跡；免疫熒光；HGF；vWF

成年動物缺血性腦損傷后可使神經(jīng)血管單元的微環(huán)境改變，能夠誘導血管發(fā)生，但所誘發(fā)的神經(jīng)血管因子的高表達只是在短時間內(nèi)有明顯變化，自體應激產(chǎn)生血管新生過程短暫，不足以恢復神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)，因此需要通過外源性藥物等作用增強和加速內(nèi)源性腦神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)重構(gòu)，促進血管新生。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是一種多肽生長因子，能特異性的促進內(nèi)皮細胞增殖［1］，進而促進缺血組織的血管新生。因此HGF可作為一種有效的促血管新生因子和神經(jīng)保護因子，對缺血性腦損傷后的血管新生和神經(jīng)發(fā)生等起重要作用［2］。血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）是由血管內(nèi)皮細胞及巨核細胞合成和分泌，是一種存在于血漿、內(nèi)皮細胞表面的糖蛋白，可作為血管內(nèi)皮細胞的標記物［3］。

藥物莫諾苷是從中藥山茱萸中分離得到的單體化合物。前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷能減小局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積、促進內(nèi)源性的神經(jīng)干細胞增殖、促進血管生成素1（Ang-1）及其受體（Tie-2）的表達［4－8］，促進血管新生。本研究采用MCAO模型觀察腦缺血再灌注7 d后患側(cè)皮層HGF及vWF的表達變化，進一步探討莫諾苷對缺血性腦損傷后血管新生的作用及機制。

1　材料和方法

1.1主要儀器和試劑

尼龍栓線，直徑0. 26 mm（2634－100）：北京沙東生物技術(shù)有限公司；超聲波細胞破碎粉碎機：JY92-II型，寧波市新芝科技研究所；電泳儀和小型垂直電泳槽：美國Biorad公司；高分辨率多模式分子成像系統(tǒng)：美國Carestream Health公司；全波長酶標儀：美國Thermo Fisher公司。HGF抗體：Abcam；β-actin抗體：中山金橋；vWF抗體：Millipore；CY3-標記熒光二抗：Invitrogen。

化合物莫諾苷，白色結(jié)晶，由宣武醫(yī)院藥物研究室自行從山茱萸中提取制備，高效液相色譜儀對組分進行分析（C18柱，柱溫35℃，乙腈－水混合（15：85）洗脫糖苷類，流速1. 0 mL/ min，檢測波長240 nm），純度98. 5%。

1.2實驗動物分組及給藥

SPF級健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠25只，體重260～280g，購于北京維通利華實驗動物中心【SCXK（京）2006－0009】，由首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院SPF級實驗動物室常規(guī)飼養(yǎng)【SYXK（京）2010 －0013】，預適應環(huán)境1周后進行實驗，環(huán)境溫度24 ±1℃，濕度55±5%。將大鼠編號1～25只，用隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、莫諾苷小（30 mg/ kg）、中（90 mg/ kg）、大（270 mg/ kg）劑量組，共5組，每組5只。莫諾苷溶于蒸餾水，MCAO造模后3 h按照30、90、270 mg/ kg劑量每天一次灌胃給藥，連續(xù)給藥7 d。假手術(shù)組和模型組給予等體積的蒸餾水。

1.3MCAO模型制備及行為學評分

模型的制備參照Longa法［9］并稍加改進。本實驗經(jīng)過首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會評估，尊重實驗中動物的福利。大鼠術(shù)前禁食不禁水12 h。稱重后將體重在260～280 g之間的大鼠用10%水合氯醛4 mL/ kg進行腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥置于手術(shù)操作臺上，用安爾碘進行頸部周圍消毒。在大鼠右側(cè)頸部切口約2 cm后，對肌肉及筋膜進行分離，注意避開甲狀腺。暴露右側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA），分離出右側(cè)頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）和頸外動脈（external carotid artery，ECA）。結(jié)扎ECA接近分叉處及CCA近心端，用動脈夾夾閉ICA，在CCA用眼科剪剪一個斜行的細小切口，將栓線小心插入，緩慢輕推栓線進入ICA，直到產(chǎn)生阻擋感，說明栓線已經(jīng)經(jīng)CCA分叉處，通過ICA入顱進入了大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA），到達了大腦前動脈（anterior cerebral artery，ACA）起始部，阻斷MCA的所有血供，造成了大腦中動脈阻塞。縫合肌肉，并在創(chuàng)口處涂少量青霉素，以預防傷口感染。栓塞30 min后，用眼科鑷緩慢向外拔出栓線，實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠不插入栓線，其余操作與MCAO手術(shù)組相同。

MCAO手術(shù)后的動物置于溫控毯上36. 5℃～37. 5℃保暖，直至動物蘇醒后觀察其行為。采用Ludmila Belayev 12分評分法進行術(shù)后行為學評分［10］：1）提尾懸空試驗：無明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對側(cè)肢體屈曲為1分，側(cè)推試驗陽性為2分。2）前肢放置試驗：A視覺亞試驗，實驗者將動物握于手中，使其前爪懸空，讓動物位于桌子前方，自桌面上方10 cm處向桌面緩慢斜線靠近，大鼠正常反應為前肢即抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應延遲。0分：動物肢體放置反應正常；1分：反應延遲但不超過2 s；2分：反應延遲且超過2 s。側(cè)方刺激，讓動物位于桌子側(cè)方，實驗檢測方法及評分標準同前方刺激。B觸覺亞實驗：將動物雙眼遮住，并使其前爪懸空，用其前爪背刺輕觸桌面，刺激深度僅達皮膚和毛發(fā)，動物反應及評分通視覺試驗，觸覺刺激同樣分前方和側(cè)方刺激。C本體覺亞實驗：操作及評分同觸覺亞實驗，僅刺激深度不同，本體覺亞實驗給予前爪較大壓力，刺激深達肌肉及關(guān)節(jié)。評分4～10分為造模成功，選擇入組。采用差額補充方法補足各組設(shè)計所需大鼠數(shù)量。

1.4Westernblotting分析HGF蛋白表達

造模7 d后將大鼠用10%水合氯醛400 mg/ kg腹腔注射麻醉，迅速剝離大腦并將腦膜剝?nèi)ィ〕龌紓?cè)皮層包入錫箔紙中，放入液氮中凍存片刻后，于－80℃保存。取出患側(cè)皮層于5 mL EP管中稱重，加入預冷的裂解液7 μL/ mg新鮮組織、PMSF 1 μL/100 μL RIPA，冰上充分超聲粉碎。4℃12000 r/ min離心30 min，取上清。采用BCA法定量蛋白濃度，并加入裂解液，調(diào)節(jié)各組總蛋白濃度一致。總蛋白加入5×上樣緩沖液1：4稀釋，95℃變性10 min。

取新鮮大鼠患側(cè)皮層腦組織裂解提取蛋白，進行SDS-PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50 μg樣品，先恒壓60 V電泳60 min；然后恒壓90V電泳至分離膠底部，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1：1000稀釋的兔抗大鼠HGF單克隆抗體，4℃過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再加入1：2000稀釋的羊抗兔IgG-HRP，室溫搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，將曝光后的圖片導入軟件Quantity One中分析。實驗重復3次。

1.5免疫熒光分析vWF表達水平

1.5.1灌注及大腦切片

10%水合氯醛4 mL/ kg腹腔注射麻醉，固定四肢，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。快速灌注生理鹽水，待右心耳流出液無色透明時，換4%多聚甲醛150 mL快速灌注，之后稍減慢灌注速度至動物四肢變硬。30 min后斷頭取腦，將腦組織浸于4%多聚甲醛中。固定完全后，將腦標本從后固定液中取出，進行冠狀面冰凍切片，厚度為40 μm。

1.5.2免疫熒光染色

大腦切片用0. 1 mol/ L PBS洗滌3次，每次5 min；置0. 1%Triton破膜20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；加入10%正常山羊血清，室溫孵育2 h，傾去；分別加入1∶200的vWF一抗，4℃孵育24 h，PBS沖洗3次，每次5 min；加入CY3-標記山羊抗鼠IgG，室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5 min；滴一滴封片劑封片，晾干；正置熒光顯微鏡觀察并攝片，采用Image-Pro Plus 6. 0圖像分析軟件計算vWF陽性血管的數(shù)目。

1.6統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以－x±SEM表示。應用SPSS 17. 0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Scheffe法進行組間兩兩比較，以P＜0. 05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1免疫印跡法觀察莫諾苷對缺血性腦損傷后HGF表達的影響

腦缺血再灌注7 d后，與假手術(shù)組相比，模型組HGF蛋白表達顯著升高（P＜0. 01）；同模型組大鼠相比，莫諾苷給藥小劑量組（30 mg/ kg）HGF蛋白表達水平提高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0. 05）；莫諾苷中劑量組（90 mg/ kg）和大劑量組（270 mg/ kg）HGF蛋白表達顯著升高（P＜0. 01，P＜0. 01）（圖1，表1）。

表1　免疫印跡法檢測HGF表達變化統(tǒng)計結(jié)果Tab. 1 The statistical results of HGF expression changed by western blot

2.2免疫熒光法觀察莫諾苷對缺血性腦損傷后vWF陽性血管數(shù)目的影響

vWF免疫熒光染色結(jié)果顯示：局灶性腦缺血后7 d，模型組梗死灶周圍可以看見一些清晰的vWF陽性血管結(jié)構(gòu)（圖2B），莫諾苷給藥中劑量組（90 mg/ kg，圖2D）和大劑量組（圖2E）的vWF陽性血管數(shù)量明顯增多。對vWF陽性血管數(shù)量進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組vWF陽性血管數(shù)量顯著增加（P＜0. 001）；與模型組相比，莫諾苷中、大劑量組（90 mg/ kg、270 mg/ kg）的vWF陽性血管數(shù)量顯著增多（P＜0. 01，P＜0. 001）；莫諾苷小劑量組（30 mg/ kg）vWF陽性血管數(shù)量與模型組比無明顯差別（圖2，表2）。

圖2　各組大鼠患側(cè)皮層vWF免疫熒光染色（×20標尺=50 μm）Note：A：sham group；B：model group；C：low morroniside group（30 mg/ kg）；D：middle morroniside group（90 mg/ kg）；E：high morroniside group（270 mg/ kg）.Fig. 2 vWF expressions in the ischemic ipsilateral cortex of the rats in each group strained by immunofluorescence（×20 Bar =50 μm）

表2　免疫熒光檢測vWF血管數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果Tab. 2 The statistical results of vWF vessels tested by immunofluorescence

3　討論

腦卒中因其高致殘率及高死亡率已嚴重威脅人類健康，成為我國居民第二死因和成人第一位致殘原因［11］。其中，缺血性腦卒中，在中國腦血管疾病中居第一位［12］，因此一直以來是臨床研究的熱點。對于缺血性腦卒中來說，腦血管重塑過程依賴于局部產(chǎn)生的血管生長因子，當局部組織損傷后，刺激血管生長因子釋放，然后到達預先存在的血管內(nèi)皮細胞，刺激其發(fā)生一系列生物活性和表型的改變，進而使血管芽生，形成有功能腔的導管［13］。新生的血管可為神經(jīng)發(fā)生提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，并為新生的神經(jīng)細胞遷移到缺血周邊區(qū)域提供依附的支架，是梗死周邊區(qū)域腦組織抗損傷和神經(jīng)元修復的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［14－16］。此外，有研究表明缺血性腦損傷患者腦內(nèi)新生血管密度與患者的存活時間存在相關(guān)性，新生血管密度增加多的患者，預后較好［17］。

肝細胞生長因子HGF等能通過不同的分子途徑促進內(nèi)皮細胞的分裂和增殖從而促進缺血組織的血管新生［18］。Miyagawa［19］等將載有HGF基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠心梗心肌，發(fā)現(xiàn)能活化轉(zhuǎn)錄因子ETs，使梗死范圍減少，梗死區(qū)血管新生較單純心肌細胞移植組顯著增加。HGF過表達能刺激血管新生和側(cè)支血管形成［20］。可見，HGF在新生血管形成過程中發(fā)揮重要的作用。并且不論在體內(nèi)還是體外試驗，HGF的促血管生成活性已被證實比VEGF及bFGF更強一些［21－22］。

vWF是一種大分子糖蛋白，內(nèi)皮細胞是血漿vWF的主要合成場所。vWF在成人糖尿病和心血管疾病中表達升高，vWF水平升高是內(nèi)皮細胞損傷或激活的標志［23］。vWF是血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cells，VEC）特異性標志之一［24］，因此常用來鑒定VEC，檢測血管新生。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠局灶性腦缺血再灌注7 d時，模型組患側(cè)皮層HGF、vWF表達明顯上調(diào)，提示缺血性腦損傷使腦梗死邊緣區(qū)神經(jīng)血管微環(huán)境改變，誘導HGF的表達短時間內(nèi)升高，血管數(shù)量增加。而灌胃給予莫諾苷后，HGF、vWF表達水平比模型組進一步提高，且升高水平與莫諾苷給藥劑量表現(xiàn)出正相關(guān)趨勢，表明莫諾苷能促進缺血性腦損傷后HGF的表達增強，促進內(nèi)皮細胞增殖，進而促進血管新生。結(jié)合前期的研究，莫諾苷對局灶性腦缺血再灌注大鼠血管新生相關(guān)因子血管生成素1及其受體Tie-2具有顯著的促進作用［13］，我們推測莫諾苷通過促進HGF表達，改善神經(jīng)血管修復的微環(huán)境，進而發(fā)揮促血管新生的作用。

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〔修回日期〕2015－11－23

Effects of morroniside on the expression of the HGF and vWF in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats

WEI Ren-ping1，2，SUN Fang-ling2，LIU Ting-ting2，CHENG Hua1，AI Hou-xi2，GUO De-yu2，TIAN Xin2，ZHU Zi-xin2，WANG Yu-feng2，ZHENG Wen-rong2，WANG-Wen1，2，3
（1. Hebei North University，Hebei Zhangjiakou 075000，China；2. Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Beijing 100053，China；3. Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing 100069，China）

【Abstract】Objective To study the effects of morroniside on the expression of the HGF and vWF of the ischemic ipsilateral cortex 7 days after ischemia reperfusion. Methods 25 male Sprague-Dawley rats were subjected to MCAO model with modified Zea Longa’s method，then randomly divided into sham group（n =5），ischmia group（n =5），and morroniside groups（low，medium，and high dosage groups，n = 5）. Morroniside were then administered intragastricallyonce a day at dose of 30 mg/ kg，90 mg/ kg and 270 mg/ kg after operation. The expression of HGF and vWF of the ischemic ipsilateral cortex were detected by western blotting and Immunofluorescence 7 days after ischemia-reperfusion. Results Compared with the sham group，the expression of HGF in ischemia group increased significantly（P＜0. 01）7 days after MCAO. Compared with the ischemia group，the expression of HGF in the morroniside groups（30 mg/ kg，90mg/ kg，270 mg/ kg）showed significant increased（P＜0. 05，P＜0. 01，P＜0. 001）. Compared with the sham group，the expression of vWF in ischemia group increased significantly（P＜0. 001）. Compared with the ischemia group，the expression of vWF in the morroniside groups（90 mg/ kg，270 mg/ kg）showed significant increased（P＜0. 01，P＜0. 001）. Conclusion Morroniside could increase the expression of HGF and vWF in the ischemic ipsilateral cortex，romoting the process of angiogenesis in focal cerebral ischemia rat.

【Key words】Morroniside；Cerebral ischemia-reperfusion；Western blotting；Immunofluorescence；HGF；VWF

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0024-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 006

［基金項目］國家自然科學基金（81373994；81173575）；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2012ZX09102201－106）。

［作者簡介］魏仁平（1988－），女，碩士生，主要研究方向：神經(jīng)藥理。E-mail：weirenping1@126. com。

［通訊作者］王文（1968－），男，研究員，研究方向：神經(jīng)藥理，中藥藥理，E-mail：lzwwang@163. com。