肺腺癌A 549綠色熒光裸鼠模型中腫瘤血管內皮細胞來源初探

方 天，胡若愚，胡文娟，劉 彪，尤金煒，惲時鋒（.南京軍區南京總醫院比較醫學科，南京 000；.東南大學附屬中大醫院胸心外科，南京 000）

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肺腺癌A 549綠色熒光裸鼠模型中腫瘤血管內皮細胞來源初探

方 天1，胡若愚2，胡文娟1，劉 彪1，尤金煒1，惲時鋒1
（1.南京軍區南京總醫院比較醫學科，南京 210002；2.東南大學附屬中大醫院胸心外科，南京 210002）

【摘要】目的 建立綠色熒光裸小鼠皮下接種肺腺癌A 549模型，研究肺腺癌腫瘤血管生成過程中血管內皮細胞的來源。方法 建立肺腺癌A 549皮下接種GFP裸小鼠模型，應用免疫熒光染色法進行CD 31染色，標記腫瘤血管；采用熒光顯微鏡觀察并拍攝腫瘤組織冰凍切片；免疫組化檢測腫瘤組織血管中內皮細胞內GFP表達。結果 免疫熒光實驗結果顯示：GFP蛋白和CD 31蛋白可共表達于部分間質血管；部分血管表達CD 31蛋白而不表達GFP蛋白。免疫組化實驗結果：腫瘤組織中部分間質細胞的細胞質和內皮細胞的細胞質表達GFP蛋白。結論 組成腫瘤新生血管的內皮細胞部分來源于裸鼠體內，部分來源于腫瘤細胞。

【關鍵詞】肺腺癌A 549；血管生成；內皮細胞；腫瘤干細胞

腫瘤的生成、轉移與腫瘤新的血管生成關系密切，腫瘤血管生成一直是人們認識腫瘤生長進程和進行腫瘤治療的一個重要途徑［1］。近年來，血管靶向藥物對于腫瘤治療有一定療效［2］，但抗腫瘤血管靶向藥物耐藥或者療效不佳（20%～37%）［3］。最近研究發現，腫瘤內發生染色體變異的內皮細胞是由腫瘤干細胞分化而來，這可能是腫瘤血管生成的另一種重要方式［4］。腫瘤干細胞的異質性，可塑性導致其功能的多樣性，它通過各種方式為腫瘤提供全面的生長所需營養及其他條件［5－6］。在肺腺癌的研究中，腫瘤干細胞與宿主裸鼠體細胞到底誰是腫瘤血管的主要來源是認識肺腺癌血管新生的重要課題。本實驗將對此作初步探索，找出組成腫瘤新生血管的內皮細胞的來源，從而為肺腺癌腫瘤血管治療提供新的治療靶點。

1　材料和方法

1.1實驗動物和主要試劑

實驗動物采用SPF級5～6周齡綠色熒光（GFP）裸小鼠12只，雄性。GFP裸小鼠由本科室選育【SCXK（軍）2012－0047】；實驗室【SYXK（軍）2012－0014】。主要試劑和儀器：肺腺癌A 549來自本院腫瘤科饋贈。胎牛血清、RPMI－1640培養液和0. 25%胰蛋白酶均購自GIBCO公司。CD 31多克隆抗體（Abcam公司），山羊抗兔CY3（谷歌生物）；GFP抗體，即ANTI-EGFP，（博奧森公司）；DAPI（谷歌生物）；抗熒光淬滅封片劑（谷歌生物）。組化試劑盒DAB顯色劑（DAKO公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2肺腺癌A 549皮下接種GFP裸小鼠模型的制備

GFP裸小鼠是將GFP基因導入BALB/ c-nu/ nu小鼠而得。具體培育過程：通過（GFP）C57BL/6轉基因小鼠與BALB/ c裸小鼠進行雜交，獲得子一代（F1），選取F1代小鼠進行自交，產生子二代（F2）代，從F2代中選擇帶綠色熒光的雄性裸小鼠與雌性熒光雜合子，進行全同胞交配，獲得的熒光裸小鼠再與BALB/ c小鼠進行回交，回交后代再自交，產生子三代（F3），F3代回交后代再自交，產生子四代（F4），如此重復，直至十五代（F15），便可成功選育出在體內能穩定表達GFP的綠色熒光裸小鼠。

肺腺癌A 549細胞株培養在完全培養基中（1640培養液+ 10%胎牛血清，pH 7. 2），置于37℃、5%CO2恒溫培養箱內，每天更換培養液，細胞培養至80%～90%融合率，0. 25%胰蛋白酶消化傳代。接種于生長狀況良好的5～6周齡GFP裸小鼠，共10只。待移植腫瘤直徑1～2 cm時，無痛處死荷瘤GFP裸小鼠，取移植腫瘤塊放置福爾馬林浸泡待用。

1.3免疫熒光檢測內皮細胞表明蛋白的表達

從荷瘤GFP裸小鼠體內，在無菌條件下取腫瘤組織塊，4%多聚甲醛浸泡24 h，30%蔗糖脫水48 h，OCT包埋保存于－80℃，制作冷凍切片。按照常規熒光免疫步驟檢測腫瘤組織塊中內皮細胞的分子標記物CD31的表達情況，簡要如下：4℃丙酮固定15 min，PBS液漂洗，山羊血清封閉，傾去，勿洗。滴加兔抗鼠多克隆抗體CD 31（1∶50）到切片上，4℃孵育過夜；PBS充分漂洗后加入CY3山羊抗兔IgG（1∶300），37℃孵育，PBS漂洗；DAPI復染細胞核；抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察CD 31和GFP蛋白表達情況。

1.4免疫組化檢測腫瘤組織中GFP蛋白的表達

制作冰凍切片步驟同上。常規免疫組化檢測腫瘤組織中GFP蛋白的表達，簡要步驟：抗原修復，血清封閉；滴加ANTI-EGFP（1：200），切片平放于濕盒內4℃孵育過夜。滴加HRP（1：200）山羊抗兔的IgG覆蓋于組織上。DAB顯色；復染細胞核；脫水封片，中性樹膠封片。倒置顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

2　結果

2.1免疫熒光檢測結果

從腫瘤組織切片免疫熒光染色結果看出：血管標記物CD 31多克隆抗體免疫熒光染色標記肺腺癌A549皮下接種腫瘤組織，DAPI染核（圖1A、D、G），倒置熒光顯微鏡觀察結果：內皮細胞分子標記物CD31蛋白在肺腺癌腫瘤間質血管有強烈的陽性表達，顯示CY3紅色熒光信號，紅色熒光信號顯示出腫瘤組織間質的血管內皮細胞或者內皮細胞簇包裹形成微血管管腔，并且管腔大小以及形態均清晰可見，但還有部分紅色熒光信號顯示無明顯管腔形態或管腔不規則（圖1B、E、H）。而GFP蛋白則顯示GFP綠色熒光信號，即腫瘤組織中部分腫瘤間質細胞和部分圍成血管的內皮細胞有綠色熒光（圖1 C、F、I）。進一步采用熒光顯微鏡觀察未進行CD 31染色的腫瘤組織冰凍切片，腫瘤組織中GFP表達得出同樣結論：有部分血管管腔中的內皮細胞表達GFP，而大部分血管管腔中內皮細胞不表達GFP（圖2）。腫瘤組織塊間質血管側面剖面免疫熒光染色結果顯示：CD 31有強烈的陽性染色，血管管腔顯示CY3紅色熒光信號（圖3B），而顯示出的GFP綠色熒光信號則相對很弱（圖3C），這表示組成腫瘤組織間質血管的內皮細胞只有一部分表達GFP，且表達GFP的內皮細胞來源于腫瘤宿主動物即GFP裸小鼠。

圖1　CD 31蛋白和GFP蛋白在腫瘤組織中的表達

2.2免疫組化檢測結果

由GFP單克隆抗體免疫組織化學染色結果表明，腫瘤組織中部分腫瘤細胞的細胞質和組成腫瘤血管的內皮細胞的細胞質表達綠色熒光蛋白（即GFP，圖3 D、E、F），這一結果與免疫熒光實驗中熒光顯微鏡下觀察到腫瘤組織冰凍切片發出GFP綠色信號熒光的結果一致（圖1 C、F、I；圖2B、D；圖3C），這表明腫瘤組織冰凍切片中腫瘤間質及間質血管管腔均有GFP蛋白表達，即免疫熒光實驗中所發出的綠色熒光是由綠色熒光蛋白發出的特異性綠色熒光。這一結果說明，熒光裸鼠體內正常成體細胞在特定條件下定向分化為內皮祖細胞或內皮細胞參與腫瘤組織中的血管新生。

3　討論

血管生成是腫瘤生長、侵襲、轉移和復發的基礎［7］。當腫瘤體積增長大于一定大小時，在沒有新生血管長入的條件下，腫瘤組織大多保持靜止狀態或者退化［8］。新生血管長入腫瘤組織以后血液供應豐富，這是因為新生血管為腫瘤組織提供足夠的營養、氧氣和大量的生長因子，從而促使腫瘤迅速生長。同時，血管生成也與腫瘤轉移有著密切的關系，腫瘤新生血管不成熟，腫瘤細胞更加容易穿透微血管壁發生轉移；腫瘤新生血管形成后，淋巴回流增加，腫瘤細胞通過淋巴管系統轉移，也是促使腫瘤轉移的重要影響因素［9］。經典的血管生成是指由內皮細胞排列圍成內皮依賴性血管，即血管壁由分化成熟的內皮細胞（endothelial cells，EC）存覆，該理論認為腫瘤細胞不參與血管壁的構成，此種生成方式一般包括出芽式血管生成、套入式血管生成［10］。而Maniotis等［11］對此有相反的觀點，通過對人眼葡萄膜黑色素瘤進行深入的研究，Maniotis等首先明確提出腫瘤細胞自身也能形成血管管道從而為腫瘤提供血供。另外，意大利國家衛生所的研究者們發現相同基因組改變的膠質瘤細胞樣本中腫瘤衍生血管細胞的數值約為20%～90%，它們之間存在明顯的差異［12］，這表明其中很大一部分組成腫瘤血管的內皮細胞是腫瘤來源的。因此，我們想在肺腺癌的研究中，首先找出組成腫瘤新生血管的內皮細胞的來源，從而阻斷新的血管生成、毀壞現有的血管從根本上讓腫瘤挨餓不能吸取營養和相關生長因子，達到抑制癌癥的發展和轉移的目的。

圖2　腫瘤組織冰凍切片中GFP表達Fig. 2 Expression of GFP on tumor frozen section

圖3　A、B、C腫瘤組織冰凍切片中CD31和GFP的表達；D、E、F免疫組化染色檢測腫瘤組織冰凍切片GFP蛋白的表達（×20）Fig. 3 A、B、C Expression of CD 31 and GFP on tumor frozen section；D、E、F Expression of GFP in tumor frozen section was detected by immunohistochemistry

為了研究肺腺癌腫瘤組織中內皮細胞的來源，本研究利用本實驗室選育的綠色熒光（GFP）裸鼠建立肺腺癌細胞A549皮下接種模型，取完整腫瘤組織塊制作冰凍切片，再利用腫瘤血管標志物CD31多克隆抗體對肺腺癌A549皮下接種腫瘤組織冰凍切片進行免疫熒光染色標記，結合熒光顯微拍攝，觀察并拍攝CD 31和GFP在腫瘤血管中的表達情況。本實驗室科研人員于2005年從美國Jackson實驗室引進表達GFP的C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10sb/ J小鼠，與普通BALB/ c裸小鼠進行雜交繁育，選育出GFP裸小鼠。利用GFP裸小鼠具有T細胞功能缺陷和系統表達GFP的雙重特點，跟蹤正常體細胞和/或腫瘤細胞在體內的走向及發展，結合現代分子影像學技術，研究癌細胞以及宿主動物之間的關系。在熒光顯微鏡下，本實驗室培育的GFP裸小鼠大部分器官都表達綠色熒光，包括心臟、肺臟、脾臟、胰腺、食管、胃和十二指腸，其中皮膚、血細胞、肌肉也表達綠色熒光；該GFP轉基因裸小鼠既保留了裸小鼠的生物學特性，在全身組織器官中又能穩定表達GFP。本實驗即是利用其血管內皮細胞（EC）表達強烈信號的綠色熒光蛋白，使其腫瘤組織內的血管在熒光顯微鏡下清晰可見，結合內皮細胞標記物CD31標記GFP裸小鼠肺腺癌模型腫瘤血管來研究肺腺癌組成新生腫瘤血管的內皮細胞來源。實驗結果顯示：內皮細胞分子標記物CD31蛋白在肺腺癌腫瘤間質血管有強烈的陽性表達，顯示CY3紅色熒光信號，紅色熒光信號顯示出腫瘤組織間質的血管內皮細胞或者內皮細胞簇包裹形成微血管管腔，并且微血管管腔大小以及形態均清晰可見，但部分紅色熒光信號顯示無明顯管腔或管腔不規則。而GFP表達結果則顯示出腫瘤組織中部分腫瘤細胞和部分圍成血管的內皮細胞有綠色熒光，即表達綠色熒光蛋白，進一步由GFP但克隆抗體免疫組織化學染色結果證實，腫瘤組織在免疫熒光實驗中所觀察到的綠色熒光信號確實特異性的，是由綠色熒光蛋白發出的。這一結果說明，熒光裸鼠體內正常成體細胞在特定條件下定向分化為內皮祖細胞或內皮細胞參與腫瘤組織中的血管新生。而有部分血管管腔中內皮細胞不表達GFP，則說明部分組成血管的內皮細胞來自腫瘤細胞A549細胞，這些細胞內不表達GFP，這一結果有力的支持了腫瘤干細胞有可能向血管內皮細胞方向分化的理論，其機制需要進一步深入研究。

隨著腫瘤研究的不斷深入，目前腫瘤生物學的研究中最具有吸引力的是腫瘤干細胞（carcinoma stem cells，CSCs）的理論，該理論認為腫瘤具有自我更新、分化潛能和侵襲能力等方面的誘導性和可逆性。成體細胞的可塑性是生物體內普遍存在的現象，現已發現多種成體干細胞在特定條件下可定向分化為內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）或內皮細胞（EC）參與血管新生。Shen等［13］的研究提示在某些條件的誘導下，腫瘤干細胞有可能向血管內皮細胞方向分化，其機制可能是通過改變局部微環境（如上皮間質轉化），以有利于后續血管新生［14］。Yao等［15］認為腫瘤微環境決定了腫瘤干細胞的可塑性，從而使腫瘤細胞模仿血管管道的而形成血管生成擬態（vasculogenic mimicy，VM）。腫瘤的維持、生長和轉移依賴于血管生成，血管生成為靶點的治療方法是近年來生物醫學研究中重要的領域［16－17］。據報道，目前血管內皮生長因子（VEGF）是已知最強的促血管生成因子［18］，多種腫瘤研究已經證實阻斷VEGF信號通路能夠降低腫瘤組織中的微血管密度，從而達到抑制腫瘤的生長的目的［19］。臨床上抗VEGF治療方法主要是通過聯合化療或者放療發揮抗癌作用［20］。由于不同類型的腫瘤抗VEGF療效不一，抗VEGF治療法經常發生耐藥［21－23］，這或許與Dll4-Notch信號通路有關［24］。聯合采用DBZ或者DAPT（γ-分泌酶抑制劑）阻斷Notch信號，或許能夠提高VEGF抑制劑的療效，并與之產生抗腫瘤協同效應。本文作者擬在此篇論文研究結論，即腫瘤干細胞有可能向功能性血管內皮細胞方向分化的理論基礎上，進一步在機制上闡明VEGF抑制劑和γ-分泌酶抑制劑等如何阻斷血管生成因子通路，從而阻止腫瘤血管的生成。

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〔修回日期〕2016－01－13

Research on the source of endothelial cells in tumor vessels by A 549 tumor model with GFP nude mouse

FANG Tian1，HU Ruo-yu2，HU Wen-juan1，LIU Biao1，YOU Jin-Wei1，YUN Shi-feng1
（1. Department of Comparative Medicine，National Science Education Base，Nanjing 210002，China，2. Department of thoracic surgery，Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University，Nanjing 210002，China）

【Abstract】Objective To explore the source of endothelial cells in tumor vessels by A 549 tumor model with GFP nude mouse. Methods To establish the A 549 lung cancer models with GFP nude mice，expression of CD 31 was determined by immunofluorescence to label tumor vessels；to observe and take a picture of the tumor frozen section by confocal microscopy and invert microscope；expression of GFP in tumor vessels was determined by immunohistochemistry. Result The results of immunofluorescence showed：Tumor interstitial vascular endothelial cells or endothelial cells clusters and micro-vascular lumen size and shape are clearly visible by immunofluorescence，and part of vessels with no obvious lumen or irregular lumen. We can see green fluorescent in tumor cells of tumor tissue and endothelial cells which form of tumor vessels. The results of immunohistochemistry showed：expression of GFP was determined in cytoplasm of tumor stromal cells and endothelial cells in tumor vessels. Conclusion The endothelial cells which formed tumor neovessels that derived from GFP nude mice partly and the other part derived from tumor cells.

【Key words】A 549；Vascularization；Endothelial cells；Carcinoma stem cells

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0046-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 010

［作者簡介］方天（1984－），女，碩士，南京軍區南京總醫院比較醫學科技師，Email：Fangtianlove@126. com。

［通訊作者］惲時鋒（1965－），男，博士，主任技師，教授，研究生導師，從事醫學實驗動物學工作，Email：yunshifeng1@163. com。