miR-187在肺癌組織中的表達及其效應

孫德彬，藍秀

（麗水市中心醫院　呼吸內科，浙江　麗水　323000）

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miR-187在肺癌組織中的表達及其效應

孫德彬，藍秀

（麗水市中心醫院呼吸內科，浙江麗水323000）

［摘 要］目的：探討微小RNA（microRNA，miR）-187在肺癌組織中的表達及其效應。方法：以U6為內參，采用莖環實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測32例肺癌及其癌旁正常組織標本miR-187的表達量，并分析其表達與肺癌臨床病理特征間的關系。采用miR-187模擬物（mimics）上調A549肺癌細胞內miR-187表達水平，通過噻唑藍（MTT）法檢測細胞活性，通過流式細胞術檢測細胞周期。結果：與癌旁正常組織比較，miR-187在肺癌組織中表達顯著下調（t=5.236，P＜0.001）。臨床病理特征相關性分析結果顯示，腫瘤組織miR-187的表達與肺癌病理分級及臨床分期相關（P＜0.05），與年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結轉移情況未見明顯相關性（P＞0.05）。采用miR-187 mimics上調A549肺癌細胞內miR-187表達后，細胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低。結論：miR-187在肺癌組織中的下調表達可能參與了肺癌的發生發展過程。

［關鍵詞］微小RNA；miR-187；肺腫瘤

肺癌的發病率與病死率在全世界范圍內增速迅猛［1］，我國目前肺癌病死率為30.61/10萬人，較30年前增加了465%，位居各種惡性腫瘤之首［2］。在后基因組時代，RNA組學研究逐漸成為熱點：基因組超過98%的轉錄產物為不編碼蛋白的非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA），其中微小RNA（microRNA，miR）可通過與靶mRNA的3’-UTR互補配對，指導mRNA切割、降解；也可通過與靶mRNA的不完全配對，沉默其表達，從而參與調控細胞的分化、生長、增殖和凋亡等［3-6］。近年來少數的研究已經證實，miR-187異常表達與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等相關，但其與肺癌的相關性迄今尚鮮見報道。為此，本研究進一步通過莖環實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法對32例肺癌組織及相對應的正常組織進行表達水平檢測，旨在分析miR-187表達與肺癌臨床病理特征的關系，并通過細胞干預實驗驗證miR-187的效應。

1　材料和方法

1.1材料 Trizol試劑、胎牛血清、lipofectamine 2000、Opti-MEM培養液、0.05% Trypsin購自美國Invitrogen公司；F12K培養基購自美國Sigma公司；DNase I、RNase-free試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；ReverTra Ace? qPCR RT Kit、SYBR? Green Realtime PCR Master Mix等購自日本Toyobo公司；miR-187模擬物（mimics）及無關序列對照購自上海吉瑪公司；A549人非小細胞肺癌細胞購自中科院上海科學研究所細胞庫；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2方法

1.2.1組織標本采集及處理：標本取自2008年6 月-2012年7月間在我院胸外科行手術治療的肺癌患者32例，術前均未行放、化療等治療，年齡32～78歲，平均（45.5±12.3）歲，組織病理類型的判斷標準參照WHO肺癌的病理學分類。每例標本留取腫瘤組織及對應的正常肺組織（腫瘤遠端5 cm處的肺組織，并經組織病理切片檢測證實），離體后10 min內置于液氮保存待做后續分析。

1.2.2小RNA抽提：取液氮保存的肺癌組織及癌旁正常組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理水溶解。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA溶液按DNase I說明書步驟進一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo公司）檢測RNA溶液OD260/OD280吸光值，計算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.3miR-187表達檢測：以U6作為內參，分析肺癌組織miR-187表達，相關分析的引物序列見表1。0.5 μg總RNA分別以U6 RT引物和miR-187莖環RT引物進行反轉錄。反轉錄體系按照ReverTra Ace? qPCR RT Kit說明書進行，反應條件為：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。以20 μL反應體系進行RT-qPCR。測反應體系包括：1 μL RT產物，1×SYBR Green I Master mix，10 μmol/L特異前向引物、10 μmol/L特異反向引物。RT-qPCR條件為：95 ℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃30 s，40個循環。所有樣品做3復孔。RT-qPCR使用ABI StepOne/StepOnePlus RT-qPCR儀器進行檢測。記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數即Ct值，以U6作為內參照，以2-ΔΔCt表示miR-187在肺癌組織相對于癌旁組織的表達。ΔCt為同一樣本目的基因與內參基因Ct值之差，即ΔCt=CtmiR-187-CtU6，△△Ct=（CtmiR-187-CtU6）腫瘤-（CtmiR-187-CtU6）正常。miR-187相對表達水平＜1，表示肺癌組織miR-187的表達水平低于配對癌旁組織miR-187的表達；miR-187相對表達水平＞1，表示肺癌組織miR-187的表達水平高于配對癌旁組織miR-187的表達。PCR產物經3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1　定量PCR檢測相關引物序列

1.2.4細胞培養及miR-187轉染：A549人非小細胞肺癌細胞用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的F12K培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，23 d傳代一次。設20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L 3個不同濃度的miR-187 mimics干預組、無關序列組（NC組）及未轉染組（Blank組）。轉染前將2×105個細胞分別接種于6孔板，培養24 h，使細胞貼壁率大約為60%～70%，將培養基替換為無血清Opti-mem培養基，按li-pofetmaine2000說明書轉染細胞，轉染24 h、48 h及72 h后去培養基，Hanks洗滌3次，加Trizol試劑收集細胞RNA，于80℃冰箱保存。

1.2.5細胞增殖與活性檢測：本次實驗設A549細胞Blank組、NC組和miR-187 mimics組（miR-187 mimics轉染濃度分別為20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L）。另設背景組（未接種細胞，只加入培養基）作為調零孔。實驗共分6個組，每組3個復孔。參照CCK-8試劑盒說明書，分別檢測上述各組細胞增殖情況。用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值（OD）。并計算細胞活力=（實驗組-空白孔）A450/（對照組-空白孔）A450×100%。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期：以2×105個細胞接種于6孔板，每孔2 mL，轉染前用無血清培養液饑餓培養24 h，使得細胞周期同步在G0/G1期。取miR-187 mimics干預組及無NC組轉染的細胞，0.25%胰酶消化，用培養液吹打，800×g離心15 min去上清，PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，用5 mL注射器將細胞吸起，打入5 mL 70%（預冷）乙醇中，4 ℃固定過夜，800×g離心15 min收集固定細胞，PBS 洗2次，用0.4 mL PBS重懸細胞并輕輕吹打，加適當濃度的RNase-A，37 ℃水浴消化30 min，加入適當濃度的PI，在冰浴中避光染色30 min，過濾，流式細胞儀（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）分析檢測，每個樣本取3個復孔，每個復孔檢測1次，獲得數據后進行結果分析。

1.3統計學處理方法 采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。miR-187表達數據以中位數和四分位數間距表示。正態分布且方差齊的數據2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，肺癌組織與其配對癌旁組織miR-187平均表達水平比較采用配對的非參數Wilcoxon符號秩檢驗；肺癌組織miR-187相對表達水平與胃癌臨床病理指標之間的關系采Mann-Whitney u檢驗（2組）和Kruskal-Wallis H檢驗（多組）進行統計學處理。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1miR-187檢測特異性分析 qPCR擴增產物的熔解曲線（見圖1A）顯示為單峰，肺癌組織和癌旁正常組織總RNA經特異引物RT-qPCR擴增后， miR-187 及U6內參的PCR產物為單一條帶（見圖1B），說明建立的RT-qPCR方法能特異檢測相應的目的基因。

圖1　miR-187和內參U6 qPCR特異性分析

圖2　肺癌組織及其配對癌旁正常肺組織miR-187平均表達水平

2.2肺癌組織miR-187表達水平 31例肺癌組織及其配對癌旁正常肺組織miR-187表達水平的RT-qPCR檢測結果（見圖2）表明，肺癌組織miR-187表達水平明顯低于配對癌旁正常肺組織（t=5.236，P＜0.001），肺癌組織miR-187相對表達水平為0.626 （0.283，0.827）。

2.3miR-187表達水平與肺癌臨床病理特征的關系 miR-187的表達在不同病理分級及臨床分期存在顯著差異（見表2）。不同病理分級的肺癌標本中，分化程度越低的肺癌組織miR-187表達水平越低（P=0.017），miR-187表達水平在III/IV期臨床分期的肺癌組織標本明顯低于I/II期的組織標本（P= 0.026）。miR-187表達水平和年齡、性別、吸煙史、腫塊大小、病理類型及淋巴結轉移情況未見明顯相關性（P＞0.05）。見表2。

表2　miR-187表達水平與腫癌臨床病理特征的關系

2.4上調miR-187表達對A549人非小細胞肺癌細胞增殖及細胞周期的影響 結果（見圖3）顯示，與Blank組和NC組比較，20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L miR-187 mimics轉染各實驗組的A549細胞增殖均明顯受到抑制，且呈濃度依賴性（P＜0.05）。miR-187 mimics轉染24 h、48 h和72 h等不同的時間點之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。細胞周期檢測結果（見圖4）顯示，與Blank組和NC組比較，miR-187 mimics各濃度組轉染的A549細胞周期分布在24 h、48 h和72 h均發生改變，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低（P＜0.05），但未見明顯的時間效應和濃度效應。

圖3　miR-187 mimics干預對A549細胞活力的影響

3　討論

miRNA是近年來在多種真核細胞和病毒中發現的一類非編碼蛋白的短序列（21～23個核苷酸）RNA片斷。它通常與靶基因的3’UTR區互補配對，指導miRNA復合體對靶基因mRNA進行切割或者翻譯抑制，抑制基因表達［7-9］。自從Calin等［8］首次報道miRNA異常表達與腫瘤有關，近十幾年來，miRNA在腫瘤的發生發展中的作用越來越受到重視。

越來越多的證據表明，miR-187可作為抑癌基因或致癌基因，與腫瘤細胞增殖和凋亡密切相關。鼻咽癌［9］、腎癌［10］、胰腺癌［11］、甲狀腺癌［12］、食管癌［13］以及神經母細胞瘤［14］等多種腫瘤，已證實存在miR-187異常表達。我們前期肺癌組織miRNA芯片檢測發現，miR-187在肺癌組織表達明顯下調表達。為驗證miR-187表達水平與肺癌的相關性，本研究以U6為內參照，采用RT-qPCR檢測了32例肺癌組織miR-187的表達。結果顯示，與癌旁正常肺組織比較，肺癌組織miR-187的表達明顯下調。臨床病理特征相關性分析顯示，miR-187的表達水平與肺癌病理分級及臨床分期相關。進一步細胞干預實驗證實，采用miR-187 mimics轉染上調細胞內miR-187表達后，細胞增殖明顯受到抑制，G0/G1期細胞比例增高，G2/M期細胞比例明顯降低。這些結果提示腫瘤組織低表達的miR-187可能參與肺癌的發生發展過程。最近有研究［15］顯示，miR-187通過調節靶基因DAB2，參與了卵巢癌的進展，也與患者的總體生存率及術后無復發生存率相關。Mulrane等［16］發現，乳腺癌組織miR-187表達水平的高、低與乳腺癌的侵襲能力相關，可以作為一個獨立的預后因素。但是不同研究者報道亦不盡相同，Cheng等［17］報道，反義抑制miR-187的表達，HeLa細胞的增殖能力下降。而Park等［18］的研究認為miR-187的過量表達，HeLa細胞的增殖能力減退，細胞凋亡增加。這些結果提示，miR-187在不同腫瘤組織可能以不同方式參與腫瘤致癌過程。

圖4　miR-187 mimics干預48 h對A549細胞周期的影響

miRNA主要通過調節靶基因表達發揮效應。Dab2［15］、MMP13［16］已被證實是miR-187的靶基因。Sirotkin等［19］研究發現miR-187的過度表達可以減少人類卵巢顆粒細胞凋亡相關蛋白質BAX和增殖細胞核抗原（PCNA）的表達。最近Helwak等［20］基于miRNA-mRNA直接相互作用的CLASH實驗發現，TUBG1、MAD2L2及STOML2是miR-187的靶基因。已經證實，MAD2L2是一個參與有絲分裂檢查點過程控制的成員的基因，與癌旁正常組織比較，結腸癌組織表達明顯上調，而且MAD2L2上調表達的結直腸癌患者不良預后［21］。STOML2是Stomatin超家族成員之一，也已經證實在多種腫瘤組織上調表達［22-25］。由于miR-187在不同類型腫瘤中的作用不同，肺癌腫瘤組下調表達的miR-187是否通過上述的靶基因發揮效應還有待于進一步驗證。

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（本文編輯：胡苗苗）

Expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect

SUN Debin， LAN Xiu. Department of Respiratory Medicine， Lishui Central Hospital， Lishui， 323000

Abstract：Objective： To explore the expression of miR-187 in the tissues of lung cancer and its effect. Methods： By normalized to U6， the expressions of miR-187 in 32 lung cancer and matched non-tumor adjacent tissue specimens were examined by stem-loop real-time RT-qPCR method. The relationship between miR-187 expression and clinicopathological characteristics was further analyzed. After transfected with miR-187 mimics， the biological functions of miR-187 were determined by cell proliferation and cell cycle assay. Results：Expression of miR-187 in the tissue of lung cancer was obviously higher than that in non-tumor adjacent tissue specimens （t=5.236， P＜0.0001）. Clinical features correlation analysis showed that the down-expression of miR-187 was correlated with the pathological grading and the clinical staging （P＜0.05）. Functional studies indicated that the overexpression of miR-187 dramatically inhibited the proliferation of A549 cells in vitro and changed the situation of the cell cycle， arrested at G0/G1 phase. Conclusion： Down-expression of miR-187 in the patients of lung cancer may play a key role in the development and progression of lung cancer.

Key words：microRNA； miR-187； lung neoplasms

［中圖分類號］R734.2

［文獻標志碼］A

DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2016.04.010

收稿日期：2015-08-19

作者簡介：孫德彬（1975-），男，浙江青田人，副主任醫師。