泛發性白癜風患者外周血體外活化后T細胞表達CD154水平的研究

萬建勣，董秀芹，劉廣仁，丁街生，肖潔平

［廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）皮膚科 廣東 廣州 510080］

?

泛發性白癜風患者外周血體外活化后T細胞表達CD154水平的研究

萬建勣，董秀芹，劉廣仁，丁街生，肖潔平

［廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）皮膚科 廣東 廣州 510080］

［摘要］目的：比較泛發性白癜風患者和正常人外周血T細胞體外活化后表達的CD154水平。方法：活化前及體外活化6h后，分別對泛發性白癜風患者及對照組外周血標記CD3，裂解紅細胞，獲取外周血有核細胞后標記CD154，流式細胞儀檢測并比較兩組CD3+T細胞CD154表達水平。結果：體外活化6h后，泛發性白癜風患者外周血CD3+T細胞CD154表達水平明顯高于對照組（P＜0.05）。結論：外周血T細胞過度表達的CD154可能通過誘導自身抗體產生及增加炎性細胞因子等途徑參與白癜風的發病機制。

［關鍵詞］白癜風；CD154；CD3；T細胞；流式細胞儀

白癜風是以全身或局部皮膚、黏膜獲得性色素脫失性白斑為主要表現的一組皮膚病，有報道其發病率最高達到2%［1］，是皮膚科門診最常見的損容性疾病之一，嚴重影響患者的生活質量及心理健康［2］，目前尚無滿意的治療方法。白癜風病因不清，關于其發病機制曾有多種假說，近年的研究結果均提示白癜風，尤其泛發性白癜風是一種自身免疫性疾病［3-4］，而且白癜風常合并系統性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）、類風濕性關節炎（Rheumatoid Arthritis，RA）及銀屑病等其他自身免疫性疾病［5-8］，合并一種以上自身免疫性疾病的幾率高達23%［7］。研究表明，上述SLE、RA及自身免疫性甲狀腺疾病等患者外周血T細胞表面分子CD154表達水平出現不同程度的異常［9-11］，而且T細胞表達CD154水平可以反映強直性脊柱炎患者病情活動性［11］，因此，推測CD154可能參與了上述白癜風相關自身免疫性疾病的發病過程，而白癜風患者T細胞表達CD154的情況尚無報道。本研究采用外周血全血體外活化的方法，免疫熒光直接染色并用流式細胞儀檢測了泛發性白癜風患者外周血T細胞活化后表達CD154的水平，并與正常人比較，現將結果報道如下。

1　資料和方法

1.1一般資料

1.1.1研究對象：50例泛發性白癜風患者均來自2014年8月-2016年2月筆者科室門診，隨機分為兩組。白癜風組：30例，男19例，女11例，平均年齡31.5歲，病程（6.15±3.44）個月；對照組：20例，男9例，女11例，平均年齡34.9歲。兩組患者在年齡和性別等方面比較，均無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：符合泛發性白癜風診斷，疾病的活動性以采血前3個月內有新皮損出現為標準，診斷標準參照文獻［12］，初次就診未經系統性治療的患者，或經治療無效，1個月內未進行系統性治療的患者，年齡18～60歲，性別不限。

排除標準：①就診前1個月內全身使用過影響免疫功能的藥物；②就診前1個月內患麻疹、流感等感染性疾病；③合并甲狀腺疾病、SLE等自身免疫性疾病或其他慢性炎癥性疾病者；④合并妊娠或肝腎功能不全及其他慢性系統疾病者；⑤合并惡性腫瘤患者。對照組選取筆者醫院體檢的健康志愿者，年齡18～60歲、性別不限，排除標準同研究組。

1.1.2主要試劑：PE-Cyanine5標記的人白細胞表面抗原CD3抗體（anti-CD3- PE-Cyanine5）、異硫氰酸熒光素標記的CD154抗體（anti-CD154-FITC ）、PE-Cyanine5標記的鼠IgG1k同型對照（Mouse IgG1 k Isotype Control PE-Cyanine5）及異硫氰酸熒光素標記的鼠IgG1k同型對照（Mouse IgG1 k Isotype Control CD154-FITC ）均購自美國eBioscience公司。佛波醇酯多克隆刺激劑（phorbol12，13-dibutyrate，PDB，Sigma公司，美國），離子霉素（Ionomycin，Ion， Lc Laboratories公司，美國），莫能菌素（Monensin，Gene Operation公司，美國）。RPMI-1640 細胞培養液（Gibco公司，美國）；紅細胞裂解液（Becton Dickinson公司，美國）；磷酸緩沖液（Phosphate-buffered saline，PBS）；細胞通透液；4%多聚甲醛固定液；1%多聚甲醛固定液。

1.1.3主要實驗器材：流式細胞儀（FACSCalibur 型，Becton Dickinson公司，美國）；CO2細胞培養箱（2300型，Sheldon公司，美國）；恒溫離心機（Megafuge 1.0R 型，Herculeus公司，德國）；24孔細胞培養板（Corning公司，美國）。

1.2方法

1.2.1全血培養與活化：取肝素抗凝血1ml，用細胞培養液稀釋到3ml，分別加入24孔培養板的空白對照孔和含有PDB（2×10-7mol/l）+Ion（1μg/ml）+ Monensin （2μmol/l）試劑孔，每孔加入1ml稀釋的全血，標本置于36.5℃～37℃、5%CO2的環境下培養6h后收獲細胞。

1.2.2表面抗原染色、外周血有核細胞的分離與檢測：采用直接免疫熒光標記，活化前后取各孔全血150μl，離心后棄100μl上清，每管加入anti-CD3- PE-Cyanine5，各5μl，標記后4℃避光放置30min，加入2ml紅細胞裂解液，室溫避光放置10min后離心去上清，PBS洗滌2次，0.5ml 4%多聚甲醛4℃固定20min。PBS 洗滌1 次，1ml 通透液洗滌1次，室溫避光放置10min，2ml通透液洗滌1次，細胞重懸于50μl通透液，加入anti- CD154-FITC，各5μl，混勻后4℃避光放置30min，用1ml 通透液洗滌2次后用1%多聚甲醛固定，全部樣本于24h內進行FACSCalibur流式細胞儀檢測和分析。

1.2.3統計學處理：所有數據使用SPSS19.0軟件進行分析，以t檢驗進行兩組間數據比較，數據以±s表示，檢驗水準為α=0.05，當P＜0.05時認為差異具有顯著性。

2　結果

未經活化的白癜風患者及正常人外周血CD3+T細胞表達少量CD154，表達率分別為（1.74±0.42）%、（1.19±0.35）%，差異無顯著性（P＞0.05）。在PDB+Ion作用下，Monensin存在條件下，體外活化6h后，白癜風組及正常人組外周血CD3+T細胞CD154表達率分別為（45.87±6.15）%和（32.24±4.52）%，差異具有顯著性（P ＜0.05），多次試驗數據和結果見表1、圖1。

表1　泛發性白癜風患者外周血CD3+T細胞體外活化6h后CD154表達情況　（±s，%）

表1　泛發性白癜風患者外周血CD3+T細胞體外活化6h后CD154表達情況　（±s，%）

注：*P＜0.05

組別 　 例數 0h 　 6h對照組 　 20 1.19±0.35 32.24±4.52白癜風組 30 1.74±0.42 43.87±6.15*

圖1　泛發性白癜風患者外周血體外活化后CD3+T細胞CD154表達情況

3　討論

T細胞表面分子CD154是CD40的配體（CD40L），也是T細胞活化的表面標記。T細胞活化后迅速表達CD154，并于6h左右達到高峰［13］。CD154主要表達于活化的CD4+T細胞，少量表達于CD8+T細胞及樹突狀細胞等細胞表面。已知白癜風患者外周血的CD4+T細胞及CD8+T細胞亞群的數量及比例無明顯異常［14］，本研究結果表明在PDB和Ion活化6h后，泛發性白癜風患者外周血CD3+T細胞表達CD154水平明顯高于對照組（P＜0.05），提示患者T細胞過度表達CD154。CD154主要生物學活性是與CD40結合后產生共刺激信號，該信號處于T細胞活化第二信號的上游，是活化Tc細胞前體及B細胞活化、增殖及免疫球蛋白類別轉換不可替代的途徑［15］，有學者認為CD154表達的異常必然會引起免疫應答的異常，甚至引起自身免疫性疾病［16］。已知白癜風患者外周血可檢測出多種自身免疫抗體［17-19］，其中甲狀腺過氧化物酶抗體的陽性率高達28%［19］，這些自身抗體可能由于T細胞過度表達的CD154導致B細胞異常活化及免疫球蛋白類別轉換異常產生。此外，CD154與多種細胞因子之間也存在著復雜的調節關系，一些異常表達的細胞因子也是白癜風發病機制中的重要因素，CD154可以上調IL-4、IL-6、INF-γ及TNF-α等細胞因子的表達水平，研究表明白癜風患者外周血中上述細胞因子的濃度均升高［20-21］，同樣可能與白癜風患者T細胞過度表達CD154有關。上述細胞因子中，INF-γ可以抑制黑素形成并誘導黑素細胞凋亡［22］，INF-γ主要來源于活化的Tc細胞，而CD154也是活化Tc細胞的主要途徑。TNF-α作為重要的炎性細胞因子，參與了多種自身免疫性疾病的發病機制，應用抗TNF-α的生物制劑治療白癜風可以使進展期的白癜風病情穩定［23］，也提示其可能參與了白癜風的色素脫失過程。此外，白癜風患者外周血也可檢測到IL-2水平明顯高于正常人［21］，而IL-2可以上調CD154表達。因此，T細胞過度表達CD154在白癜風發病機制中的因果關系尚有待進一步研究。

綜上所述，泛發性白癜風患者外周血T細胞過度表達的CD154可能通過誘導自身抗體產生及上調某些炎性細胞因子等途徑參與了白癜風的發病過程，也提示阻斷CD154-CD40路徑可能成為治療泛發性白癜風的新途徑。阻斷CD154-CD40路徑藥物曾是10余年前治療自身免疫性疾病及抗移植排斥的熱點，抗CD154單克隆抗體藥物上市后由于易引發血栓栓子等不良事件而撤回。近幾年，隨著上述不良反應的機制逐漸明了，克服不良反應后，阻斷CD154-CD40路徑又成為治療自身免疫性疾病新的希望［24］，這也為泛發性白癜風的治療提供了新的可能。

［參考文獻］

［1］Halder RM，Chappell JL.Vitiligo update［J］.Semin Cutan Med Surg，2009，28（2）: 86-92.

［2］Amer AA，Gao XH.Quality of life in patients with vitiligo: an analysis of the dermatology life quality index outcome over the past two decades［J］.Int J Dermatol， 2016，doi: 10.1111/ijd.13198.

［3］Li S，Yao W，Pan Q，et al. Association analysis revealed one susceptibility locus for vitiligo with immune-related diseases in the Chinese Han population［J］. Immunogenetics，2015，67（7）:347-354.

［4］Lee YH，Bae SC.Associations between TNF-α polymorphisms and susceptibility to rheumatoid arthritis and vitiligo:a meta-analysis［J］. Genet Mol Res，2015， 14（2）:5548-5559.

［5］Silverberg JI，Silverberg NB.Clinical features of vitiligo associated with comorbid autoimmune disease: a prospective survey［J］. J Am Acad Dermatol，2013，69（5）: 824-826.

［6］張雅君，劉玲，李強.白癜風10821例伴發疾病的研究與分析［J］.中國美容醫學，2012，21（11）:1589-1592.

［7］Sheth VM， Guo Y， Qureshi AA. Comorbidities associated with vitiligo: A Ten-Year retrospective study［J］.Dermatology，2013，227（4）:311-315.

［8］Gill L，Zarbo A，Isedeh P，et al. Comorbid autoimmune diseases in patients with vitiligo: A cross-sectional study［J］.J Am Acad Dermatol，2016，74（2）:295-302.

［9］Baker RL， Mallevaey T，Gapin L，et al. T cells interact with T cells via CD40-CD154 to promote autoimmunity in type 1 diabetes［J］.Eur J Immunol，2012，42（3）:672-680.

［10］Alaaeddine N， Hassan GS，Yacoub D，et al.CD154: an immuneinflammatory mediator in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis［J］. Clin Dev Immunol， 2012，2012:490148.

［11］林曲，林智明，古潔若，等.強直性脊柱炎患者外周血T淋巴細胞亞群和T淋巴細胞上CD154表達的變化和意義［J］.中華風濕病學雜志，2008，12（5）:309-313.

［12］中國中西醫結合學會皮膚性病專業委員會色素病學組.白癜風臨床分型及療效標準（2003年修訂稿）［J］.中華皮膚科雜志，2004，37（7）:440.

［13］Sallusto F，Lenig D， F?rster R，et al. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions［J］. Nature，1999，401（6754）: 708-712.

［14］Pichler R，Sfetsos K，Badics B，et al. Lymphocyte imbalance in vitiligo patients indicated by elevated CD4+/CD8+ T-cell ratio［J］. Wien Med Wochenschr，2009， 159（13-14）:337-341.

［15］Hernandez MG， Shen L， Rock KL. CD40-CD40 ligand interaction between dendritic cells and CD8+T cells is needed to stimulate maximal T cell responses in the absence of CD4+T cell help［J］.J Immunol，2007，178（5）:2844-2852.

［16］Peters AL，Stunz LL，Bishop GA.CD40 and autoimmunity: the dark side of a great activator［J］.Semin Immunol，2009，21（5）:293-300.

［17］Al-Shobaili HA，Rasheed Z.Oxidized tyrosinase: A possible antigenic stimulus for non-segmentalvitiligo autoantibodies［J］.J Dermatol Sci，2015，79（3）:203-213.

［18］Zhu MC，Liu CG，Wang DX，et al.Detection of serum anti-melanocyte antibodies and identification of related antigens in patients with vitiligo［J］.Genet Mol Res， 2015，14（4）:16060-16073.

［19］Dash R， Mohapatra A， Manjunathswamy BS，et al. Anti-Thyroid Peroxidase Antibody in Vitiligo: A Prevalence Study ［J］.J Thyroid Res，2015，2015:192736.

［20］隋連金，戎麗娟，王煒.白癜風患者血清相關細胞因子的檢測［J］.中國麻風皮膚病雜志，2006，22（5）:386-388.

［21］Tsiskarishvili NV， Katsitadze A， Tsiskarishvili NI， et al. Peculiarities of cytokine status in patients with vitiligo and stress in anamnesis［J］. Georgian Med News，2014，235:45-48.

［22］Yang L，Wei Y，Sun Y，et al. Interferon-gamma Inhibits Melanogenesis and Induces Apoptosis in Melanocytes: A Pivotal Role of CD8+Cytotoxic T Lymphocytes in Vitiligo［J］.Acta Derm Venereol，2015，95（6）:664-670.

［23］Webb KC，Tung R，Winterfield LS，et al. Tumour necrosis factoralpha inhibition can stabilize disease in progressive vitiligo［J］.Br J Dermatol，2015，173（3）: 641-650.

［24］Pinelli DF，Ford ML.Novel insights into anti-CD40/CD154 immunotherapy in transplant tolerance［J］.Immunotherapy，2015，7（4）:399-410.

編輯/李陽利

Studies on expression levels of CD154 active on T cells from human peripheral blood of patients with generalized vitiligo

WAN Jian-ji， DONG Xiu-qin， LIU Guang-ren， DING Jie-sheng， XIAO Jie-ping
（Department of Dermatology，Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，Guangdong，China）

Abstract:Objective To investigate the expressing levels of CD154 on T cells from peripheral blood of patients with generalized vitiligo in response to in vitro stimulation， and compare with that of the normal. Methods Before and after cultured in vitro for 6h， the whole blood was stained with CD3，the nucleated cells were stained with CD154 after separated by lysing the red blood cells.The expressing rates of CD154 on CD3+T cells were detected by flow cytometer. Results Cultured in vitro for 6h， the expression rates of CD154 on CD3+T cells of vitiligo group were significantly higher than that of the control group （P＜0.05）. Conclusions Over expressed CD154 on T cells maybe play a role in the pathogenesis of generalized vitiligo by inducing some autoantibodies and proinflammatory cytokines.

Key words:vitiligo；CD154；CD3；T lymphocyte；flow cytometer

［中圖分類號］R758.4+1

［文獻標志碼］A

［文章編號］1008-6455（2016）05-0063-03

基金項目：廣東省醫學科研基金項目（A2014046）

通信作者：董秀芹，廣東省人民醫院（廣東省醫學科學院）皮膚科行政主任、主任醫師；主要從事激光美容及白癜風、銀屑病等免疫性皮膚病的研究；E-mail：dxq1996@163.com

［收稿日期］2016-03-21 ［修回日期］2016-04-30