楊梅S-SAP分子標記體系的建立及應用

焦 云，舒巧云，劉珠琴，章建紅

(寧波市農業科學研究院 林業研究所，浙江 寧波 315040)

楊梅S-SAP分子標記體系的建立及應用

焦 云，舒巧云，劉珠琴，章建紅

(寧波市農業科學研究院 林業研究所，浙江 寧波 315040)

摘要：基于楊梅全基因組Ty1-copia類型逆轉座子LTR序列設計開發S-SAP引物組合，利用48份楊梅試材對其多態性指數進行評價，使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean)法，構建了系統聚類樹，并進行了二維和三維主坐標分析，進而探討了楊梅種質資源遺傳親緣關系。成功開發了18個楊梅S-SAP引物組合，共擴增獲得3739個條帶，平均每個引物組合可擴增208個條帶(100～500 bp)，每個引物組合擴增條帶數量范圍為98～292，Shannon信息指數范圍為0.2041～0.4522。其中，引物組合JY20的多態性最高，可擴增出292個條帶。基于18個S-SAP引物組合，使用UPGMA法構建所有試材的系統聚類樹，結果共分為3個組及3個亞組。聚類分析與主坐標分析結果高度相似，具有相同地域來源的品種大部分被劃分于同一個分組，使用聚類分析與主坐標分析所得結果基本一致，但是聚類結果與果實色澤沒有明顯的關聯性，利用三維主坐標分析更能全面且真實地反映楊梅品種間的親緣關系。

關鍵詞：楊梅；S-SAP；分子標記；遺傳多樣性

隨著分子生物學技術的發展，現在DNA分子標記技術已有數十種，廣泛應用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關系鑒別、基因庫構建、基因克隆等方面。其中，逆轉座子分子標記之一的S-SAP(Sequence-Specific Amplification Polymorphism)是根據AFLP演變而來，其擴增的多態性一方面來源于限制性位點及其兩側序列的變異，與AFLP檢測的變異相同；另一方面來源于LTR 5′末端的變異和反轉錄轉座子插入位點的變異，在理論上其多態性高于AFLP。與其他類型分子標記相比，S-SAP分子標記的多態性較高，利用其評價獲得的植物分類及進化分析結果更接近于基于地理和形態上的分析結果，進而可以非常有效地進行品種或基因型的鑒定，尤其在芽變性狀的鑒定方面更具靈敏性[1-2]，因此，它被認為是多態性最豐富、靈敏度最高、反映的多態信息含量最多的一種分子標記類型。

目前，S-SAP分子標記技術已經成功應用于葡萄[1]、蘋果[2]、桃[3]等果樹的遺傳多樣性分析，由于逆轉座子引物的開發具有種族特異性，不同物種之間的逆轉座子引物異質性很大，至今尚無S-SAP分子標記技術在楊梅遺傳多樣性分析應用的報道。本研究基于前期楊梅全基因組測序結果，深入挖掘Ty1-copia類逆轉座子長末端重復序列LTR(Long Terminal Repeat)信息，并建立適合于楊梅的S-SAP分子標記技術體系，為進一步利用該標記開展楊梅遺傳多樣性分析及相關基因組學研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

從不同省份收集48份楊梅材料用于S-SAP分子標記開發及遺傳多樣性分析，具體來源見表1。從健康植株上分別采集無病蟲害的嫩葉，放入預先準備好的液氮中迅速冷凍，然后轉入-80 ℃冰箱中保存，楊梅基因組DNA使用快速離心柱型植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP3112，百泰克)進行提取。

表1　48份實驗材料相關信息

1.2實驗方法

1.2.1S-SAP分子標記引物設計使用逆轉座子預測軟件LTR_STRUC version 1.1對楊梅全基因組DNA序列進行分析。在預測結果數據中優先選擇兩端LTR序列相似度大于99%的逆轉座子，使用Primer Premier 5.0并參考3′端LTR區域序列，設計S-SAP分子標記中選擇性擴增所需的下游引物，在設計該引物時僅選擇從本區域5′端第一個堿基開始，同時替換第一個堿基為錯配堿基，設計引物長度為19～23 bp，在特異選擇性擴增引物末端添加4個選擇性堿基(GAG、CGT、GGT、TCC)，從而形成不同引物組合，同時在其5′端添加18 bp的通用引物序列(M13)TGTAAAACGACGGCCAGT，Tail中的5′端分別添加3種不同的熒光基團，即FAM、HEX和PET，用于后期使用遺傳分析儀進行擴增產物的檢測與分析。相關引物序列見表2，委托上海英駿生物技術有限公司合成，用超純水溶解。

1.2.2雙酶切、預擴增及選擇性擴增具體方法參照相關文獻[3]進行。

1.2.3基因型分型檢測與數據分析取上述選擇性擴增產物等比例混合后，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司在ABI 3730遺傳分析儀上進行檢測。擴增產物片段大小用Genemapper 4.0(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)軟件進行讀數，只統計長度范圍在100～500 bp內的擴增產物片段，然后使用Microsoft Excel 2007構建數據矩陣表(1表示有條帶，0表示無條帶)；使用POPGENE Version 1.32軟件計算所有引物組合的Shannon信息指數和有效等位基因數；基于Dice系數[4]計算遺傳距離，使用非加權組平均法(UPGMA)及Free Tree Version 0.9.1.50軟件進行聚類分析，其中bootstrap值設置為1000，聚類圖的修改使用Tree view 1.6.6軟件；基于Dice系數的遺傳距離使用NTSYS-pc Version 2.1軟件進行主坐標分析。

表2　本研究中S-SAP分子標記引物組合信息表

注：M和E之后的小寫字母代表選擇性堿基。

2結果與分析

2.1S-SAP引物組合多態性分析

基于楊梅全基因組DNA序列，使用LTR_STRUC version 1.1軟件分析預測逆轉座子LTR位點，在預測結果中選擇3個LTR區域相似度大于99%且長度大于150 bp的Ty1-copia逆轉座子進行引物設計，共設計24個引物組合用于選擇性擴增，隨機選擇8個楊梅品種進行引物組合的預篩選及有效性鑒定。結果發現：18個引物組合成功擴增，占總引物的75%；然后使用48份楊梅試材對這些引物組合進行多態性評價，結果共擴增出3739個100～500 bp的條帶，平均每個引物可擴增208個條帶(表3)。此外，平均有效等位基因位點數量和Shannon信息指數分別為1.3750和0.3599。每個引物組合擴增條帶數量范圍為3～193，其中，引物組合JY20的多態性最高，可擴增出292個條帶，Shannon信息指數為0.4481。

表3　S-SAP引物組合特征信息表

注：Ne代表有效等位基因數；I代表Shannon遺傳多樣性指數。

2.2楊梅種質資源遺傳多樣性分析

基于18個S-SAP引物組合并使用UPGMA構建48份試材的遺傳親緣關系聚類樹(圖1)，共分為3個組及3個亞組。A組包含有A-1、A-2、A-3亞組。A-1亞組包括19份試材，包括荸薺和白楊梅等主栽品種。J2015-9、J2015-10、J2015-11為早熟優株，它們與荸薺品種劃分于同一分支，意味著它們可能與荸薺品種的親緣關系比較近。A-2亞組包括有9份試材，主要為大果類型品種，例如東魁、瑞光及來自浙江麗水的J2015-6等。A-3亞組主要是來自廣東的楊梅品種。B組包括有12份試材，其中包括來自江蘇的著名品種大浮大葉細蒂和大浮小葉細蒂。而C組品種均來自于江蘇。

基于Nei等[4]遺傳距離系數進行主坐標分析，前3個主坐標的方差貢獻率分別為8.7%、7.4%和5.0%(圖2-Ⅰ)，通過比較圖1和圖2可以看出,系統聚類分析和主坐標分析所得結果基本上一致。但是值得注意的是，圖2-Ⅰ中A-3亞組的27號樣品在聚類分析(圖1)及圖2-Ⅱ中均被劃分于B組；另外，其B組中的4和15號樣品在聚類分析(圖1)以及三維主坐標分析(圖2-Ⅱ)均劃分于C組，除此以外，其他品種的分類結果一致，由此可知，盡管聚類分析與三維主坐標分析結果完全一致，但是后者能夠進一步從不同方向、不同層次展示各品種間的親緣關系。

圖1　48份楊梅試材UPGMA聚類樹

Ⅰ.二維散點圖；Ⅱ.三維散點圖；A-1、A-2、A-3和

3討論與結論

在前期研究中，一些DNA分子標記技術，例如AFLP、ISSR和SSR已經廣泛應用于楊梅遺傳多樣性研究分析中[5-15]。然而，盡管大量的分子標記相繼被開發，但是還不夠全面且多態性普遍較低，在同等條件下用于鑒定同等數量植物品種及基因型則需要較高的實驗成本。事實上，每種分子標記技術都是基于不同原理，但它們都或多或少可以反映來自基因組的變異[16]；其中，S-SAP是一種基于基因組中普遍存在的、多拷貝、高度異質、插入位點多態的反轉錄轉座子的分子標記，其技術體系比較成熟，也是多態性及靈敏度最高的分子標記之一，可以高效地進行植物品種鑒定，目前已在柑橘[16]、番茄[17]、萵苣[18]等植物上得到應用。本研究共獲得18個S-SAP引物組合，平均每個引物組合可擴增獲得208個條帶，遠高于前期研究中AFLP分子標記的多態性(39.3個條帶)[12]、ISSR分子標記(4.9個條帶)[6]、SSR分子標記多態性(8.3個條帶)[5]。由此可見，S-SAP分子標記對于品種鑒定具有更高的多態性和檢測效率。此外，基于前期的研究基礎[3,19]，在選擇性擴增過程中加入一個嵌有熒光基團的通用引物M13，并在選擇性擴增引物上游添加M13序列，該方法可以較大幅度降低實驗成本，避免了使用傳統聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染等繁瑣的操作方法，同時大幅度提高了檢測分辨率，可以廣泛應用于今后楊梅遺傳多樣性分析研究及基因組學的深入開展。

通過對48份楊梅試材的聚類分析發現，聚類結果與地域來源具有較為密切的關系，但是聚類分析以及主坐標分析結果均表明與果實色澤性狀沒有較為明顯的聯系，意味著楊梅果實色澤性狀的形成具有較為復雜的遺傳決定機制，具體原因還需要今后進一步探索研究，該結果與前期研究一致[5,9]。另外，聚類分析中B組中的大浮烏梅和馬山白楊梅均為來自江蘇的品種，它們聚在一個獨立的分支且遠離其他品種，由此可見，兩者具有較為獨特的遺傳背景。同時，值得注意的是，圖2-Ⅰ中A-3亞組的27號樣品在主坐標三維散點圖中(圖2-Ⅱ)被劃分于B組，事實上從后者圖中可以看出，27號樣品與B組樣品的三維空間距離較小，說明它們之間的親緣關系更為接近，故而將其劃分于B組更能真實反映品種間的親緣關系，該結果與聚類分析結果一致，然而，三維主坐標分析能提供更加全面且豐富的信息。因此，在基于相同遺傳距離計算方法的條件下，可以優先選擇采用三維主坐標分析的方法。

總之，本研究中所構建的S-SAP分子標記體系具有高效、穩定和便捷的特點；此外，利用該分子標記技術進行遺傳多樣性分析能夠較為真實地反映品種之間的親緣關系，因此，該技術可為今后在楊梅遺傳多樣性等方面研究提供有效的手段。

參考文獻：

[1] Labra M, Imazio S, Grassi F, et al. Vine-1 retrotransposon-based sequence-specific amplified polymorphism forVitisviniferaL. genotyping[J]. Plant Breeding, 2004, 123(2): 180-185.

[2] 何平，李林光，李慧峰，等.S-SAP分子標記開發及其在蘋果芽變鑒別上的應用[J].植物遺傳資源學報，2013(2)：298-302.

[3] Jiao Y, Ma R J, Shen Z J, et al. Development of Ty1-copiaretrotransposon-based S-SAP molecular markers for the study of genetic diversity in peach[J]. Biochem Syst Ecol, 2014, 57: 270-277.

[4] Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. P Natl Acad Sci USA, 1979, 76(10): 5269-5273.

[5] Jiao Y, Jia H M, Li X W, et al. Development of simple sequence repeat (SSR) markers from a genome survey of Chinese bayberry (Myricarubra)[J]. BMC Genomics, 2012, 5(11): 151-154.

[6] Xie X B, Qiu Y Y, Ke L P, et al. Microsatellite primers in red bayberry,Myricarubra(Myricaceae)[J]. Am J Bot, 2011, 98(4): 93-95.

[7] Zhang S M, Gao Z S, Xu C J, et al. Genetic diversity of Chinese bayberry (MyricarubraSieb. et Zucc.) accessions revealed by Amplified Fragment Length Polymorphism[J]. Hortscience, 2009, 44(2): 487-491.

[8] Zhang S Y, Li X, Feng C, et al. Development and characterization of 109 polymorphic EST-SSRs derived from the Chinese bayberry (Myricarubra, Myricaceae) transcriptome[J]. Am J Bot, 2012, 99(12): 501-507.

[9] Xie R J, Zhou J, Wang G Y, et al. Cultivar Identification and genetic diversity of Chinese bayberry (Myricarubra) accessions based on fluorescent SSR markers[J]. Plant Mol Biol Rep, 2011, 29(3): 554-562.

[10] Zhang S, Xu C, Gao Z, et al. Development and characterization of microsatellite markers for Chinese bayberry (MyricarubraSieb. & Zucc.)[J]. Conserv Genet, 2009, 10(5): 1605-1607.

[11] Terakawa M, Kikuchi S, Kanetani S, et al. Characterization of 13 polymorphic microsatellite loci for an evergreen tree,Myricarubra[J]. Mol Ecol Notes, 2006, 6(3): 709-711.

[12] 張水明.基于AFLP和SSR分子標記的中國楊梅遺傳多樣性分析[D].杭州：浙江大學，2009.

[13] 鄭金土，張望舒，鮑露，等.荸薺種楊梅變異新株系甬選56號的主要生物學特征及其AFLP鑒別[J].果樹學報，2006(3)：397-400.

[14] Jia H M, Shen Y T, Jiao Y, et al. Development of 107 SSR markers from whole genome shotgun sequences of Chinese bayberry (Myricarubra) and their application in seedling identification[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2014, 15(11): 997-1005.

[15] Jia H M, Jiao Y, Wang G Y, et al. Genetic diversity of male and female Chinese bayberry (Myricarubra) populations and identification of sex-associated markers[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1): 394.

[16] Biswas M K, Chai l J, Amar M H, et al. Comparative analysis of genetic diversity inCitrusgermplasm collection using AFLP, S-SAP, SAMPL and SSR markers[J]. Scientia Horticulturae, 2011, 129(4): 798-803.

[17] Tam S M, Mhiri C, Vogelaar A, et al. Comparative analyses of genetic diversities within tomato and pepper collections detected by retrotransposon-based S-SAP, AFLP and SSR[J]. Theor Appl Genet, 2005, 110(5): 819-831.

[18] Pasquali M, Saravanakumar D, Gullino M L, et al. Sequence-specific amplified polymorphism (S-SAP) technique to analyseFusariumoxysporumf. sp. lactucae VCG 0300 isolate from lettuce[J]. J Plant Pahtology, 2008, 90(3): 527-535.

[19] Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]. Nat biotechnol, 2000, 18(2): 233-234.

(責任編輯：曾小軍)

Establishment and Application of S-SAP Molecular Marker System in Chinese Bayberry (Myricarubra)

JIAO Yun, SHU Qiao-yun, LIU Zhu-qin, ZHANG Jian-hong

(Institute of Forestry, Ningbo Academy of Agricultural Science, Ningbo 315040, China)

Abstract：Designed S-SAP markers based on the LTR (long terminal repeat) sequences of Ty1-copia retrotransposons, used them for DNA profiling of 48 individuals of Chinese bayberry, evaluated the index of polymorphism, constructed a distance tree using clustering with UPGMA, and two-dimensional and three-dimensional plot principal coordinate analysis (PCO) were performed to analyze the genetic relationship of the Chinese bayberry samples. Successfully obtained amplicons from 18 primer combinations, analyzed yielded an average of 208 fragments per primer combination, adding up to a total of 3739 polymorphic fragments whose sizes ranged from 100 to 500 base pairs (bp). The number of markers for each genotype ranged from 98 to 292, and Shannon’s information index ranged from 0.2041～0.4522. The primer combination JY20 generated a total of 292 bands and was the most polymorphic. Reconstructed a UPGMA tree based on the above-mentioned 18 S-SAP markers, which were further divided into three groups and three subgroups. The cluster analysis and principal coordinate analysis results showed that the accessions in the same geographical region were more closely related than those from different regions, and which did not correlate with fruit color, using the three-dimensional plot of the PCO analysis could be more fully and more truly explain the genetic relationships of samples.

Key words：Chinese bayberry; S-SAP; Molecular markers; Genetic diversity

收稿日期：2015-09-24

基金項目：寧波市農業科學研究院院長基金(2015NKYP001)。

作者簡介：焦云(1983─)，男，河北石家莊人，副研究員，博士，研究方向：果樹遺傳育種與栽培技術。

中圖分類號：S667.6

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)04-0001-06