千金止帶丸中染色劑金胺O的檢測方法研究

趙夢杰，魏伯平，孫韜

·炮制制劑·

千金止帶丸中染色劑金胺O的檢測方法研究

趙夢杰，魏伯平，孫韜

目的：建立千金止帶丸中染色劑金胺O的檢測方法。方法：采用HPLC-PDA法對千金止帶丸中金胺O進行篩查，并采用HPLC- Q-TOF/MS對陽性樣品進行確證。結果：對來自7家企業的71批次樣品進行篩查和確認發現：有2家企業的11批次樣品中檢出金胺O；金胺O進樣在0.082～82.08 μg．mL-1范圍內有良好的線性關系。結論：本方法準確可靠，可作為千金止帶丸中金胺O的檢測方法。

千金止帶丸；金胺O；液相色譜法；液相色譜質譜聯用法

千金止帶丸由黨參、白術、當歸、白芍、延胡索等17味藥材配伍制成，具有健脾補腎、調經止帶等功效，用于脾腎兩虛所致的月經不調、帶下病的治療[1]。本方來源于孫思邈的《千金方》，現收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部。其處方中有一味原料藥延胡索，市場上發現常被非法染料金胺O染色，使得千金止帶丸有金胺O殘留的風險[2,3]。金胺O屬于工業染色劑，可刺激皮膚黏膜，引起結膜炎、皮炎和上呼吸道刺激癥狀，人接觸或者吸入金胺O會引起中毒。且金胺O較難以自然降解，體內殘留物具有致癌、致突變、致畸等毒性，我國在2008年發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中將其列為非食用物質[4-8]。為保證用藥安全，有必要對千金止帶丸中金胺O建立檢測方法。本文采用HPLC-PDA對千金止帶丸中的染色劑金胺O進行篩查，并采用液相色譜-質譜聯用（HPLC-Q-TOF/MS）法對陽性結果進行確認。結果：來自7家企業的71批次樣品進行篩查和確認發現：有2家企業的11批次樣品中檢出金胺O；建立了千金止帶丸中的染色劑金胺O的檢測方法，為打擊千金止帶丸原料中的非法染色行為提供了技術手段。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（美國Waters 2695），二級管陣列檢測器（美國Waters PDA 2996）；液相色譜聯用儀（美國Agilent 1290 ，美國Agilent 6540 Q-TOF/ MS）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；腈、乙酸銨為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。金胺O（中國藥品生物制品檢定所，批號111770-200701）；千金止帶丸樣品來源于全國7個生產企業的71批次樣品。

2 方法與結果

2.1 HPLC-PDA篩查

2.1.1 供試品溶液制備 本品，研細，取約2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加60%甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理20 min，取出，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取金胺O對照品適量，加60%甲醇制成每1 mL含2 μg的溶液。

2.1.3 色譜條件與系統適用性試驗 采用Waters Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.01 mol/L乙酸銨溶液（40：60）；流速：1 mL．min-1;柱溫：35 ℃;檢測波長為438 nm。理論塔板數按金胺O色譜峰計算，應不得低于3000。取對照品溶液和供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見圖1。

圖1 金胺O對照品（A）、陽性供試品(B)的HPLC圖

2.1.4 專屬性試驗

2.1.4.1 HPLC-PDA法 采用二極管陣列檢測器比較相應色譜峰在300～650 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜，千金止帶丸陽性樣品與金胺O對照的紫外-可見光譜基本一致。結果見圖2。

圖2 金胺O對照品（A）、陽性供試品(B)的PDA吸收光譜圖

2.1.4.2 HPLC- Q-TOF/MS法 離子源：ESI正離子模式；毛細管電壓：4500V；干燥氣流速：9 L/min ；干燥氣溫度：350℃；掃描范圍：100～500m/z ；起始加速電壓：100V (一級)；100V (二級) ；碰撞電壓：10～30V; 采樣錐電壓：60V；其他色譜條件同上。準分子離子與碎片的質譜圖見圖3。

圖3 金胺O對照品（A）、陽性供試品(B)的準分子離子（Ⅰ）與碎片（Ⅱ）的質譜圖

2.1.5 篩查結果 共篩查7家企業的71批千金止帶丸樣品，其中2家企業的11批樣品色譜中檢出與金胺O對照品色譜保留時間相同的色譜峰，該峰在300～650 nm波長范圍的紫外-可見吸收光譜與對照品基本一致，見表1。

表1 千金止帶丸樣品篩查結果

2.1.6 陽性樣品確認 2家企業的11批千金止帶丸樣品采用HPLC-Q-TOF/MS進行確認，在與金胺O對照品色譜保留時間相同的位置出現色譜峰，且與對照的準分子離子和碎片離子質譜圖基本一致。

2.2 HPLC含量測定

供試品溶液、對照品溶液的制備及色譜條件同上“2.1”項下各項。

2.2.1 線性關系考察 取金胺O對照品溶液適量, 加60%甲醇依次稀釋為每1mL含金胺O 0.08208、0.4104、1.642、8.208、41.04、82.08 μg．mL-1的標準溶液, 分別取5μL，注入液相色譜儀分析, 以對照品峰面積Y對進樣量X（ng）進行線性回歸計算，結果：回歸方程為Y=9666X-9804, r=0.9995 ，表明金胺O在進樣0.082～82.08μg．mL-1的濃度范圍內線性關系良好。

2.2.2 精密度試驗 精密吸取上述濃度為1.642 μg．mL-1的對照品溶液5 μL，連續進樣6針，分別記錄峰面積，結果金胺O的RSD為1.1%，表明進樣精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 取千金止帶丸，制備供試品溶液各6份，分別注入液相色譜儀，測定并計算，結果金胺O含量平均值為2.4 μg．g-1，RSD為2.1%，表明方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取“2.2.3”項下的同一千金止帶丸供試品溶液，室溫下放置，精密吸取5 μL，分別在0、2、4、8、16、24h注入液相色譜儀。金胺O色譜峰面積的RSD為1.5%，說明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收試驗 精密稱取未檢出金胺O的千金止帶丸樣品2 g，共稱定6份,置具塞錐形瓶中，加入41.04 μg．mL-1的金胺O標準溶液0.1 mL，揮干溶劑后，同“2.1.1”項下制備供試品溶液并測定，計算回收率，結果金胺O平均回收率為102.04%，RSD為2.88%，表明該方法的準確度良好，見表2。

表2 加樣回收試驗結果

2.2.6 檢出限和定量限 取“2.1”項下的金胺O對照品溶液，用60%甲醇進行逐步稀釋，進樣5μL，在選定的色譜條件下, 按信噪比的3倍值和10倍值計算, 測得金胺O的檢出限0.02 μg．mL-1，定量限為0.06 μg．mL-1。

2.2.7 樣品測定 取千金止帶丸陽性樣品，照“2.1.1”項下制備供試品溶液并測定，用外標法計算含量，測定結果見表1。

3 討論

3.1 金胺O裂解碎片分析 碎片離子是二級質譜的重要鑒別點，金胺O的準分子離子m/z268擊碎后，一般會產生m/z252、m/z 147，見圖4。

圖4 金胺O裂解碎片離子

3.2 流動相系統的選擇 有文獻[8][9]采用乙腈-0.025moL．L-1磷酸鹽緩沖液（含0.2%的三乙胺，用磷酸調節pH到3.0）（30：70）分離測定金胺O, 本文采用了更為簡單流動相乙腈-0.01moL．L-1乙酸銨溶液（40：60），也取得了滿意的分離效果，且可以直接適用于液質聯用儀，更為方便。

3.3 本文建立的千金止帶丸中金胺O的檢測方法，準確迅速，可以有效打擊在千金止帶丸原料中添加金胺O的違法行為，從結果看，有2家企業的11批次的樣品檢出金胺O染色劑，表明千金止帶丸有被非食用化工染色劑污染的風險，提示企業應定期對影響原料質量的風險因素進行監測分析，監管部門也應定期開展監督檢查，防范非食用化工染色劑污染中成藥制劑。

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(責任編輯：李蕓霞)

Detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pill

/ZHAO Meng-jie1, WEI Bo-ping2, SUN Tao2/(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan; 2. Sichuan Institute for Food and Drug Control, Chengdu, 610097, Sichuan)

Objective:To establish a method for detection of dye auramine O in Qianjinzhidai pills.Method:HPLC-PDA was used as a screening method for auramine O .The positive results were further confirmed by HPLC- Q-TOF/MS.Result:71 batches of qianjinzhidai pills from 7 manufacturer were detected and confirmed. Auramine O was detected from 11 batches of samples in 2 manufacturers. Auramine O had considerable linear relationship in range of 0.082～82.08 μg．mL-1.Conclusion:This method is accurate and reliable, and can be used as the detection method for auramine O in Qianjinzhidai pill．

Qianjinzhidai pill; auramine O; HPLC; HPLC-MS

R 283

A

1674-926X(2016)05-006-03

1. 成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137; 2.四川省食品藥品檢驗檢測院，四川 成都 610097

趙夢杰，女，在讀碩士，主要從事中藥藥效物質基礎及其安全性評價研究

Tel：18224472725 Email： 846684378@qq.com

魏伯平，男，主管藥師，主要從事中藥質量控制與安全性研究 Email：weiboping@gmail.com

2016-03-09