海藻酸鈉-聚丙烯酰胺固定氧化亞鐵硫桿菌技術的研究

廖澤君，蔡萍莉，王永東，史文革，鄒　延

(1南華大學核資源工程學院，湖南 衡陽 421001；2鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室，湖南 衡陽 421001；3南華大學城市建設學院，湖南 衡陽 421001)

海藻酸鈉-聚丙烯酰胺固定氧化亞鐵硫桿菌技術的研究

廖澤君1，蔡萍莉3，王永東2，史文革1，鄒延1

(1南華大學核資源工程學院，湖南 衡陽 421001；2鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室，湖南 衡陽 421001；3南華大學城市建設學院，湖南 衡陽 421001)

摘要：以海藻酸鈉(SA)、聚丙烯酰胺(HPAM)為復合載體，加入聚乙二醇(PEG)為致孔劑，對氧化亞鐵硫桿菌進行固定化研究。實驗考察了SA、HPAM、PEG的濃度對SA-HPAM凝膠微球的機械強度及固定化細胞的氧化活性的影響，確定了三種材料的最佳濃度：SA為2.5%，HPAM為0.4%，PEG為2%，此條件下固定化細胞對Fe2+的最大氧化速率可達2.853 g·(L·h)-1，24h后Fe2+的氧化率在98%以上，固定化細胞目前重復使用了15次，并在3 ℃冰箱中存放兩個月后，依然具有很好的氧化活性，表明SA-HPAM固定化的氧化亞鐵硫桿菌具有較好的穩定性。

關鍵詞：固定化；氧化亞鐵硫桿菌；海藻酸鈉；聚丙烯酰胺；氧化；穩定性

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌[1](Acidithiobacillus ferrooxidans，簡稱A.f菌)在有氧條件下能氧化酸性環境中的Fe2+離子和低價態硫，并從這一過程獲取維持其自身生長繁殖的能量[2]。該菌可以通過直接作用和間接作用兩種機制氧化硫化礦，其中間接作用機制是利用A.f菌的代謝產物Fe3+和H2SO4對硫化礦或方鉛礦進行氧化[3]。作為最主要的浸礦微生物，可應用于低品位銅、鈾、金、鋅、鈷等礦的浸出。

然而，游離態的A.f菌密度小，對Fe2+的氧化緩慢。將A.f菌固定化，可以增加細菌密度，具有提高氧化速率和浸出效率，縮短浸礦周期，循環利用等諸多優點。因此，固定化A.f菌技術得到了廣泛的研究。劉曉偉[4]以活性炭為載體固定化A.f菌，蘇峰[5]采用新型固定化載體通過吸附法固定A.f菌，結果表明，相比游離態A.f菌，固定化A.f菌對Fe2+的氧化速率明顯提高，但都存在不同程度的局限性。

SA作為常用的固定化載體，對微生物毒性小，操作簡單，價格低廉，但機械強度較低；HPAM的交聯體機械強度高，穩定性好，但是固定化操控性差。本實驗以海藻酸鈉-聚丙烯酰胺為載體，加入PEG為致孔劑，以CaCl2、檸檬酸鋁為交聯劑，用包埋法固定A.f菌。考察了不同條件下固定化A.f菌小球的機械強度及其對Fe2+的氧化能力，確定最佳固定化條件，以考察這種固定化技術的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1)菌種。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，由南華大學鈾礦冶生物技術國防重點學科實驗室提供。

2) 9k液體培養基。A液：K2HPO40.5g，KCl 0.1g，(NH4)2SO43g，Ca(NO3)20.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水800mL，pH值為2.0，120℃高溫滅菌15min；B液：FeSO4·7H2O 39.71g，加入200mL容量瓶定容，pH值為2.0，抽濾除菌。A、B液混合后Fe2+濃度為8g/L。

3)主要試劑和儀器。海藻酸鈉(化學純，天津市風船化學試劑科技有限公司)，聚丙烯酰胺(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，CaCl2(分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司)，聚乙二醇400(分析純，天津市曉晶精細化工有限公司)，檸檬酸鋁(分析純，成都艾科達化學試劑有限公司)。雷磁pHSJ-3F實驗室pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，Dai-Ds-2012R疊加式大容量恒溫培養搖床(上海世平實驗設備有限公司)，Z36HK臺式高速冷凍離心機(德國HERMLE公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2氧化亞鐵硫桿菌擴大培養與收集

將A.f菌菌種按10%接種量接種至9k培養基，于搖床中31℃、120 r·min-1條件下培養50～60 h，用離心機將培養液2000 r·min-1離心5 min，去沉淀后于13500 r·min-1、3℃條件下離心15 min，用蒸餾水清洗并收集A.f菌細胞，放入3℃冰箱冷藏備用。

1.3細胞固定化

稱取一定量的SA、HPAM，分別于沸水浴中溶解，密封并于室溫條件存放8～12 h，按一定比例將SA、HPAM溶液及PEG混合，加入A.f菌細胞液，充分混合后用2.5 mL注射器滴入濃度為2%(w/v)的CaCl2溶液，置于3℃冰箱內交聯6 h后濾出小球，轉入2%檸檬酸鋁溶液中交聯6 h，濾出小球并用蒸餾水反復清洗，放置于3℃的冰箱12 h后取出于室溫風干，備用。

1.4小球機械強度測定

每組選取四顆大小均勻的小球置于兩塊載玻片之間的四個角，載玻片平放于桌面，在載玻片上放置小燒杯，往燒杯緩慢注入蒸餾水并觀察小球形狀變化。等小球形狀輕微扁平時停止加水，稱量上層載玻片、小燒杯及燒杯中水的質量，計算其總重力，以評價小球的機械強度。

1.5小球氧化能力測定

分別取大小均勻的小球20 mL，接種至含9k培養基(200 mL)的錐形瓶中，恒溫培養搖床中30℃、120 r·min-1條件下活化并連續培養。測定培養液中Fe2+濃度并計算Fe2+的最大氧化速率、轉化率等，以此評價各組小球的氧化能力。

1.6分析方法

Fe2+及全鐵濃度用鄰菲啰啉分光光度法測定[6]，細菌數量用血球計數板計數法。

2結果與討論

2.1海藻酸鈉(SA)濃度對小球的影響

SA濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%(w/v)，其余條件均相同，固定A.f菌制凝膠小球。

小球機械強度測試結果如表1所示，SA濃度越大，小球機械強度越大。

表1　SA濃度對小球機械強度的影響

固定化細胞經活化培養后接種至新的9k培養基，定時測培養液中Fe2+的濃度，結果見圖1，對Fe2+最大氧化速率見表2，相同時刻SA濃度為2.5%的組分的培養基Fe2+濃度最低，說明其固定化細胞的氧化活性最強，其最大氧化速率亦為最大值2.63 g·(L·h)-1。由此選擇SA最佳濃度為2.5%。

2.2聚丙烯酰胺(HPAM)濃度對小球的影響

HPAM濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%(w/v)，其余條件均相同，固定A.f菌制凝膠小球。

小球機械強度測試結果見表3，隨HPAM濃度增加而增加，其機械強度也就增加。

小球經活化培養后，轉入新的9k培養基，測得培養基中Fe2+濃度變化如圖2所示，固定化細胞的最大氧化速率如表4所示。相同時刻HPAM濃度為0.4%的組分中Fe2+濃度最低，說明其固定化細胞的氧化活性最強，最大氧化速率達到最大值2.697 g·(L·h)-1。由此選擇HPAM最佳濃度為0.4%。

2.3聚乙二醇濃度(PEG)對小球的影響

PEG濃度分別為0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%(v/v)，其余條件均相同，固定化A.f菌制凝膠小球。

小球機械強度測試結果見表5，PEG濃度越大，小球孔隙度越大，機械強度越低。

圖1　SA濃度對Fe2+濃度的影響

SA濃度1%1.5%2%2.5%3%3.5%4%最大氧化速率/g·(L·h)-11.9842.3852.5642.632.4272.3392.078

表3　HPAM濃度對小球機械強度的影響

圖2　HPAM濃度對培養基中Fe2+濃度的影響

HPAM濃度0.10%0.20%0.30%0.40%0.50%0.60%0.70%最大氧化速率/g·(L·h)-12.4012.4972.532.6972.5692.3121.908

表5　PEG對小球機械強度的影響

小球活化后接種至新培養基，測得培養液中Fe2+濃度變化如圖3，最大氧化速率如表6。相同時刻PEG濃度為2%的組分中Fe2+濃度最低，說明其固定化細胞的氧化活性最強，最大氧化速率達到最大值2.853 g·(L·h)-1。由此選擇PEG的最佳濃度為2%。

圖3　PEG濃度對培養基中Fe2+濃度的影響

PEG濃度0%0.5%1%1.5%2%2.5%3%3.5%最大氧化速率/g·(L·h)-12.4992.5472.6422.7782.8532.7412.3871.807

2.4小球的穩定性

按實驗所選擇的最佳包埋條件：SA濃度為2.5%，HPAM濃度為0.4%，PEG濃度為2%包埋A.f菌制凝膠小球，活化后轉移至新培養基，定時測培養基中Fe2+、Fe3+濃度，結果見圖4。固定化細胞將Fe2+逐漸氧化成Fe3+，使Fe3+濃度逐漸增加，24 h左右時Fe2+已被氧化了98%，培養基中Fe3+濃度達到最大值，其后由于水解等作用，Fe3+濃度略降低。培養基pH值變化見圖5，pH值呈先增后降趨勢，在16 h左右達到最大值2.55。

圖4　培養基中Fe2+、Fe3+濃度變化

圖5　培養基pH值變化

用檸檬酸三鈉與碳酸氫鈉的混合溶液溶解小球[7]，并用血球計數板統計平均每顆小球內A.f菌數量，結果見圖6。在第16 h左右時平均每顆小球內A.f菌數量達到最大值7.5×106個左右，增殖比例為1.51，16 h以后小球內A.f菌數略微下降。

每隔24 h將固定化細胞轉移新培養基，并測定此時舊培養基中Fe2+的氧化率r，以此評價固定化細胞氧化活力的穩定性，結果見圖7。第1d對Fe2+的氧化率為98.32%，第15 d對Fe2+的氧化率為84.78%，氧化活性略有下降。將小球濾出清洗后放入新培養基并于3℃冰箱中冷藏，兩個月后取出小球，活化后接種至新培養基，24 h后測得Fe2+的氧化率為68.08%，說明其氧化活性保持良好。

圖6　平均每顆小球內A.f菌的數量

圖7　固定化細胞的穩定性

3結論

根據實驗選擇的三種材料最佳濃度：SA

2.5%，HPAM 0.4%，PEG 2%，在此條件下固定化A.f菌制得凝膠小球，經培養后測得Fe2+最大氧化速率為2.853 g·(L·h)-1。培養16 h小時后，平均每顆小球內細胞數量達到最大值7.5×106個左右，是固定化初期的1.51倍。固定化細胞到目前重復使用15 d以后，固定化細胞的氧化能力因為黃鉀鐵礬的附著作用，使得小球體積略有增加，氧化活性略有下降。將小球濾出再冷藏兩個月，活化后依舊保持良好氧化活性。由此試驗取得了較好的結果，證明用這種技術固定化A.f菌具有良好可行性。

參考文獻

[1]Colmer A R，Hinkle M E.The role of microorganisms in acid mine drainage：a preliminary report [J].Science，1947，106(2751)：253-256.

[2]Temple K L，Colmer A R.The Autotrophic Oxidation of Iron by A New Batrum：ThiobacillusFerrooxidans[J].Journal of Bacteriology，1951，62(5)：605-611.

[3]陳炳輝，壬夢媛，萬茉莉，等.氧化亞鐵硫桿菌對方鉛礦的生物氧化作用初步研究[J].地球與環境，2011，39(4)：503-510.

[4]劉曉偉.氧化亞鐵硫桿菌脫除SO2的實驗研究[D].西安：西安建筑科技大學，2013.

[5]蘇峰.利用固定化生物-化學反應器脫除硫化氫[D].蘭州：蘭州大學，2012.

[6]王彤，姜言權.試驗[M].北京：高等教育出版社，2002：93-97.

[7]薛偉明，于煒婷，劉袖洞，等.載細胞海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊的化學破囊方法研究[J].高等學校化學學報，2004，25(7)：1342-1346.

Technology of immobilized acidithiobacillus ferrooxidans with SA-HPAM

LIAO Ze-jun1，CAI Ping-li3，WANG Yong-dong2，SHI Wen-ge1，ZOU Yan1

(1.College of Nuclear Resources Engineering，University of South China，Hengyang 421001,China；2.Key Discipline Laboratory for National Defense for Biotechnology in Uranium Mining and Hydrometallurgy，University of south China，Hengyang 421001,China；3.College of City Construction，University of South China，Hengyang 421001,China)

Abstract:The SA and HPAM was used as compound carrier，and the PEG was added as pore-foaming agent to study the immobilized technology of acidithiobacillus ferrooxidans.Effect of concentration of the three materials on the mechanical strength of gelatinous microspheres and the activity of immobilized cells have been investigated.The optimal concentration of the three materials for SA-HPAM co-immobilization was obtained：mass fraction of SA solution 2.5%，mass fraction of HPAM solution 0.4%，volume fraction of PEG solution 2%.The rate of maximum oxidation was 2.853 g·(L·h)-1of the immobilized cells for Fe2+，and 98% of ferrous ions can be oxidized within 24 hours in that optimal condition.The oxidative activity of the immobilized cells still kept all right after the immobilized cells were reused for 15 times and refrigerated in the 3 ℃ refrigerator for two months.It show the good stability of SA-HPAM co-immobilized Acidithiobacillus ferrooxidans.

Key words：immobilization；acidithiobacillus ferrooxidans；sodium Alginate；hydrolyzed polyacryamide；oxidation；stability

收稿日期：2015-02-15

作者簡介：廖澤君(1990-)，男，南華大學2012級碩士研究生，研究方向為溶浸采鈾。E-mail：zerliao2009@163.com。 通訊作者：史文革(1967-)，男，漢族，湖南衡陽人，教授，博士，目前在南華大學從事科研與教學工作，研究方向為溶浸采鈾與濕法冶金。E-mail：741446938@qq.com。

中圖分類號：Q939.9

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4051(2016)03-0150-04