表皮葡萄球菌icaADBC操縱子檢出與細菌耐氨基糖苷類抗菌藥物的關系

包裕杰，張雯雁，葉楊芹，奚　婷，陳芳瑩，范列英

(同濟大學附屬上海市東方醫院檢驗科　200120)

·論著·

表皮葡萄球菌icaADBC操縱子檢出與細菌耐氨基糖苷類抗菌藥物的關系

包裕杰，張雯雁，葉楊芹，奚婷，陳芳瑩，范列英

(同濟大學附屬上海市東方醫院檢驗科200120)

摘要:目的分析臨床分離表皮葡萄球菌對不同類型氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥特征；分析icaADBC操縱子在臨床分離的表皮葡萄球菌中的檢出及與細菌耐藥的關系。方法收集2013年1～10月上海市東方醫院臨床分離的表皮葡萄球菌77株，采用紙片擴散法檢測細菌4種氨基糖苷類抗菌藥物(慶大霉素、鏈霉素、奈替米星和阿米卡星)藥敏試驗特征；構建icaADBC特異性引物，采用聚合酶鏈反應擴增技術檢測77株細菌中icaADBC的分布狀況。結果結果77株表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高，分別為慶大霉素：62.3%，鏈霉素：61.0%，阿米卡星：22.1%，奈替米星：23.4%。icaADBC操縱子的檢出率為20.8%，ica陽性菌株與陰性菌株對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論臨床分離的icaADBC操縱子陽性表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高。

關鍵詞:icaADBC；表皮葡萄球菌；氨基糖苷類抗菌藥物

表皮葡萄球菌是一種革蘭染色陽性、凝固酶陰性的葡萄球菌，一般黏附于人體的皮膚和黏膜，是重要的條件致病菌。隨著插管、透析技術、人工心瓣膜、人工關節和人工晶體等醫療材料的廣泛應用，人口老年化及免疫低下人群的出現等，表皮葡萄球菌的感染日趨嚴重。已證實icaADBC操縱子編碼產物是表皮葡萄球菌生物膜的主要成分[1]。本研究分析icaADBC操縱子在臨床分離表皮葡萄球菌中的檢出率，以及細菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥情況，進而明確分析icaADBC與細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的關系，現報道如下。

1材料與方法

1.1菌株來源標準菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)，由上海市臨床檢驗中心提供，作為本研究的藥敏試驗質控菌株及陰性對照菌株；臨床分離菌株為2013年1～10月上海市東方醫院臨床分離表皮葡萄球菌77株。

1.2抗菌藥物和培養基抗菌藥物：慶大霉素(10 μg/mL),奈替米星(30 μg/mL),鏈霉素(10 μg/mL),阿米卡星(30 μg/mL)，藥敏試驗用培養基(MH瓊脂)為英國Oxoid公司產品，血瓊脂平板為北京賽墨飛世爾有限公司產品。

1.3儀器與試劑Micro-Scan Walkaway-96全自動微生物鑒定系統；ABI-7000熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)分析儀，Tanon-2500凝膠成像系統。PCR所需試劑購自上海閃晶生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗采用紙片擴散法(K-B法)對所有表皮葡萄球菌臨床分離菌株及質控菌株做氨基糖苷類抗菌藥物藥敏試驗，包括慶大霉素、奈替米星、鏈霉素和阿米卡星。結果按照CLSI2015版判斷標準執行[2]。

1.4.2模板DNA制備將各臨床分離菌株及質控菌株接種于血瓊脂平板，置37 ℃培養過夜，取適量菌落加入300 μL生理鹽水，混勻，10 000 r/min離心5 min；棄上清，加入300 μL雙蒸水，混勻，煮沸100 ℃，15 min；12 000 r/min離心2 min；取上清液為DNA模板。

1.4.3構建引物icaADBC特異性引物:icaA上游引物為5′-GAT GGG CTC AAG GCG GGC AT-3′;icaA下游引物為5′-TGC CTC TGT CTG GGC TTG ACC-3′。icaC上游引物為5′-ACG CAA TAT TTT TAT TTT CGG CAC CCC-3′；icaC下游引物為5′-ACT CTC TTA ACA TCA TTC CGA CGC CT-3′。

1.4.4PCR擴增50 μLPCR 擴增體系：MgCl2(25 mmol)，dNTP(10 mmol)，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)，10×PCR Buffer(25 mmol)，上游引物(50 pmol)，下游引物(50 pmol)，DNA模板5 μL。PCR反應擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 5 min。

1.4.5PCR擴增產物分析1.2%瓊脂糖凝膠于1×硼酸緩沖液，用0.5 μg/mL溴化乙錠染色，150 V電壓下電泳約30 min，將PCR擴增所得特異性片段克隆測序,并在MegaBlast上進行基因序列比對。

1.5統計學處理采用SPSS19.0軟件進行統計分析，計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.14種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥結果見表1。

表1　　77株表皮葡萄球菌對氨基糖苷類

2.2PCR擴增結果

2.2.1icaA PCR擴增結果77株表皮葡萄球菌臨床分離菌株中有16株檢出icaA，檢出率為20.8%，特異性片段長度在300～400 bp(圖1),將PCR擴增得到特異性片段克隆測序，片段長度為386 bp。

圖1　　icaA PCR擴增結果

注：條帶1、3、4、6～9為凝固酶陰性葡萄球菌臨床分離菌株，條帶5為DL500 ladder，條帶2為ATCC 25923。

2.2.2icaC PCR擴增結果選取之前檢測到icaA位點的16株表皮葡萄球菌，對其進行icaC位點檢測。其中有8株檢測到icaC位點，檢出率為50.0%，特異性片段長度在800～1 000 bp(圖2)。將PCR擴增得到特異性片段克隆測序，片段長度為807 bp。

注：條帶1為100 bp ladder，條帶2～8、10為表皮葡萄球菌臨床分離菌株，條帶9為金黃色葡萄球菌質控菌株(陰性對照)。

圖2icaC PCR擴增結果

2.3氨基糖苷類抗菌藥物藥敏試驗結果與ica檢出結果分析77株表皮葡萄球菌臨床分離株中ica陽性菌有16株，占20.8%；ica陰性菌有61株，占79.2%。16株陽性菌對慶大霉素耐藥的有15株,占93.8%,還有1株敏感，占6.2%；對阿米卡星耐藥的有10株,占62.5%，中介有2株,占12.5%，敏感有4株，占25.0%；對鏈霉素耐藥的有15株,占93.8%，還有1株中介，占6.2%；對奈替米星耐藥的有10株,占62.5%，中介有2株,占12.5%，敏感有4株，占25.0%(表2)。

表2　　16株ica陽性菌株細菌耐藥性結果[n(%)]

2.4icaADBC檢出結果與細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥性關系見表3。

表3　　表皮葡萄球菌ica檢出與細菌對氨基糖苷類

注：R表示細菌對抗菌藥物耐藥；NR表示細菌對抗菌藥物非耐藥(敏感或中介)。

3討論

表皮葡萄球菌是一種常見的條件感染病原菌[3]。由于表皮葡萄球菌分泌的毒性因子較金黃色葡萄球菌少，導致其致病的主要因素是伴隨“異物”(高分子材料如塑料等)進入人體，并通過黏附形成生物膜[4-5]。它不僅使宿主體內的免疫反應呈抑制狀態，促使表皮葡萄球菌增殖，而且其黏液阻礙了親水性的抗菌藥物進人菌體發揮殺菌作用，引起表皮葡萄球菌對抗菌藥物的多重耐藥[6]。

氨基糖苷類抗菌藥物是一類重要的抗感染藥物，具有水溶性好、化學性質穩定、抗菌譜廣、抗菌能力強和吸收排泄良好等特點。因其具有濃度依賴性快速殺菌作用、與β-內酰胺類抗菌藥物產生協同作用、細菌耐藥性低、臨床有效和價廉等優點，是目前臨床常用藥物[7-8]。

本研究以慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素和奈替米星作為代表藥物檢測表皮葡萄球菌的耐藥特征，結果顯示，對慶大霉素耐藥率為62.3%，對阿米卡星耐藥率為22.1%，對鏈霉素耐藥率為61.0%，對奈替米星耐藥率為23.4%。由此說明試驗菌株對氨基糖苷類抗菌藥物有不同程度耐藥，其中對半人工合成的阿米卡星及奈替米星耐藥率較直接由微生物產生的鏈霉素和慶大霉素低。

icaA編碼是412個氨基酸組成的跨膜蛋白，Staphylococcus carbosus體外多糖胞間黏附素(PIA)合成試驗表明，icaA單獨呈現低的N-乙酰葡萄糖胺轉移酶活性,icaC編碼是355個氨基酸組成的疏水蛋白，icaC與外排作用有關，可有效抵擋抗菌藥物侵入[9-10]。

本研究先檢測了icaA位點及其與表皮葡萄球菌臨床分離菌株對慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素和奈替米星這4種氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的關系。結果77株表皮葡萄球菌臨床分離菌株中icaA陽性菌有16株，占20.8%，這16株陽性菌對慶大霉素和鏈霉素均耐藥有15株,占93.8%；對阿米卡星和奈替米星均耐藥有10株,占62.5%。經統計學分析發現，細菌檢出ica與細菌耐氨基糖苷類抗菌藥物差異有統計學意義。

已證實細菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥的主要原因是細菌產生氨基糖苷類鈍化酶AAC(6′)-APH(2″),編碼此酶的耐藥基因可由復合型轉座子Tn4001轉入并整合到染色體中。插入序列IS256是復合轉座子Tn4001的組成部分，IS256可參與icaADBC的表達調控。葡萄球菌生物膜的形成主要是由操縱子icaADBC的表達所介導，它能編碼產生多糖細胞間外源凝集素的酶PIA,經過相變異產生PIA，這個過程受IS256在操縱子ica插入熱點上交替的插入和切除影響[11]。通過上述關聯可以在一定程度解釋為何產生生物膜的表皮葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥[12]。

綜上所述，表皮葡萄球菌臨床分離菌株對氨基糖苷類抗菌藥物耐藥率較高，對半合成類抗菌藥物耐藥率相對較低，因此臨床用藥應優先考慮此類藥物。含有icaADBC的細菌往往對氨基糖苷類抗菌藥物表現出更高的耐藥性，或與細菌生物膜形成有關，應增加細菌對抗菌藥物的抵抗力，值得臨床進一步研究。

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Relationship between icaADBC in Staphylococcus epidermidis and the resistance to aminoglycosides

BAOYujie,ZHANGWenyan,YEYangqin,XITing,CHENFangying,FANLieying

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShanghaiEastHospitalAffiliatedofTongjiUniversity,Shanghai200120,China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus epidermidis to different kinds of aminoglycoside and to explore the relationship between icaADBC in Staphylococcus epidermidis and the resistance to aminoglycosides.MethodsAntimicrobial susceptibility to different aminoglycosides including gentamicin,streptomycin,netimicin and amikacin were tested in 77 isolated strains by the agar diffusion method.The iac ADBC specific primers were constructed.And the icaADBC of 77 strains were detected by PCR amplification technology.ResultsThe resistance to aminoglycosides were as following:23.4%,61.0%,22.1% and 62.3%of the 77 strains were resistant to netilmicin,streptomycin,amikacin and gentamicin,respectively.Among the 77 stains,the positive rate of icaADBC was 20.8%.The differences of resistance to aminoglycosides between ica positive strains and ica negative strains had statistic significance(P<0.05).ConclusionClinical Staphylococcus epidermidis isolated with icaADBC show high percentage of resistance to aminoglycosides.

Key words:icaADBC;Staphylococcus epidermidis;aminoglycosides

作者簡介：包裕杰，男，主管技師，主要從事臨床微生物領域方面的研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.11.012

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)11-1479-03

(收稿日期：2015-12-21修回日期：2016-03-13)