當歸對陰虛哮喘BALB/c小鼠肺水通道蛋白1、5表達的影響

李榮科　李海龍　王志旺　程小麗　李　巖　陳張敏　妥海燕　任　遠

(甘肅中醫藥大學，甘肅　蘭州　730000)

·基礎研究·

當歸對陰虛哮喘BALB/c小鼠肺水通道蛋白1、5表達的影響

李榮科李海龍王志旺1程小麗李巖陳張敏妥海燕任遠1

(甘肅中醫藥大學，甘肅蘭州730000)

〔摘要〕目的探討當歸對陰虛哮喘小鼠的平喘作用及對水通道蛋白(AQP)1、AQP5表達的影響。方法將小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、地塞米松組、3個當歸劑量組、當歸與地塞米松組，通過注射卵清白蛋白(OVA)致敏、吸入OVA激發復制哮喘模型，實驗后期給予甲狀腺素復制成陰虛哮喘BALB/c小鼠模型，觀測當歸對哮喘發作鼠數、肺液清除功能、肺組織AQP1、AQP5及其基因表達的影響。結果2、4、8 g/kg當歸可明顯減少哮喘發作鼠數，促進肺水代謝平衡，促進肺組織AQP1、AQP5及其基因的表達(P<0.05，0.01)。同時，當歸與地塞米松配伍后對AQP1、AQP5及其基因表達有一定的協同作用(P<0.05)。結論當歸治療哮喘的機制之一是調節AQP1、AQP5及其基因表達而促進肺水代謝平衡。

〔關鍵詞〕當歸；陰虛哮喘；水通道蛋白1；水通道蛋白5

當歸為大宗中藥材之一，其“主咳逆上氣”、防治呼吸系統疾病的作用〔1〕一直受到中醫藥學界的重視。研究顯示，當歸及其制劑對哮喘有明顯的治療作用，當歸揮發油對豚鼠氣管平滑肌有明顯的解痙作用〔2〕。水通道蛋白(AQPs)在調節水代謝平衡及炎性反應過程中具有重要作用〔3〕。本次實驗采用卵清白蛋白(OVA)與甲狀腺素復制陰虛哮喘小鼠模型，擬從肺組織AQP1、AQP5的表達來探討當歸的平喘作用機制。

1材料與方法

1.1動物、試藥及主要儀器雌性SPF級BALB/c小鼠，體質量16～20 g，由蘭州獸醫研究所(中國農業科學院)提供，動物許可證62000600000082；實驗動物中心(甘肅中醫藥大學)飼養，使用號00000115。甘肅省岷縣的當歸，經本校楊扶德教授鑒定，購買時間：2014年10月18日；Grade V Sigma公司的OVA、磷酸組胺(Hist)及氯化乙酰膽堿(Ach)，批號：SLBF0342V、WXBB2337V、BCSK5705V；山東中泰藥業有限公司的甲狀腺片，國藥準字H37021712，批號14080303；國藥集團容生制藥有限公司的地塞米松注射液，國藥準字H41020036，批號13011911；北京博奧森生物技術有限公司的AQP1、AQP5免疫組化試劑盒，批號：AD091513、AD111342；日本TaKaRa公司的RNAico Plus，批號：AA1608-1；日本TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒，批號：AK3501。將當歸藥材陰干后，悶潤切片，陰干，冷凍儲存；實驗時，取當歸適量，分別加入10倍、8倍量水，煎煮50、30 min，過濾，合并濾液，適當濃縮，1℃～5℃冷藏，1 w內使用。USA的鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(CH Technologies)，美國伯樂公司的Real-Time熒光定量PCR儀(CFX型)，澳大利亞Dynamica公司的臺式冷凍離心機(VELOCITY18R型)，日本Olympus的光學顯微鏡(CH-212型)，成都泰盟科技有限公司的醫學圖像分析系統(BI-2000型)。

1.2實驗方法

1.2.1分組、造模及給藥將84只BALB/c小鼠隨機分為7組，適應性飼養1 w。實驗第1天開始致敏，即模型對照組、地塞米松組(地塞米松0.5 mg/kg)、當歸高、中、低劑量組(當歸8、4、2 g/kg)以及當歸中+地米組(當歸、地塞米松分別為4 g/kg、0.5 mg/kg)小鼠每只腹腔注射新鮮配制的致敏液〔內含OVA 100 μg、氫氧化鋁3 mg的生理鹽水(NS)混懸液〕0.2 ml，同時背部皮下注射致敏液0.2 ml，正常對照組以NS代替致敏；第8天依上法再致敏一次。從第15天開始激發，將小鼠置于吸入染毒系統中，加入激發液(1% OVA生理鹽水)，調節霧化速度至2 ml/min，使小鼠均勻吸入激發液20 min，隔日1次，連續28 d，正常對照組以NS代替激發。從實驗第15天開始，各組小鼠按上述劑量灌胃給藥20 ml/kg，其中正常對照組與模型對照組灌胃NS，1次/d，連續28 d。從第29天開始，小鼠給受試藥8 h后，按120 mg/kg灌胃甲狀腺素(用0.5%黃原膠助懸)〔4〕，1次/d，連續14 d，正常對照組灌胃NS 20 ml/kg。

1.2.2支氣管激發實驗在實驗過程中的第41天與第42天進行。分別以2%OVA與0.2% Hist和2% Ach混合物為激發液，將小鼠置于吸入染毒暴露系統內，2 ml/min霧化吸入激發液120 s，從霧化開始觀察10 min內哮喘發作的鼠數。哮喘發作的癥狀主要有呼吸急促，呼吸頻率明顯加快、焦躁不安，甚至呼吸過程中急促點頭、腹式呼吸等〔5〕。

1.2.3采集標本、測定指標實驗第43天，麻醉并處死動物后摘取肺臟，于固定位置將肺臟分成3份：第1份肺組織準確稱取濕重，充分干燥至恒重后稱取干重，計算濕干重比值(W/D)；第2份肺組織經甲醛固定、石蠟包埋、切片后免疫組化染色等步驟觀察AQP1、AQP5的表達并進行半定量分析；第3份肺組織經NS漂洗后冷凍，采用Real-time qPCR法測定AQP1、AQP5 mRNA的表達水平。

1.2.4采用Real-time qPCR法測定肺組織AQP1的基因表達采用經典的Trizol法提取總RNA，應用Bio-RAd核酸定量分析儀測定RNA的純度與濃度，使A260 nm/A280 nm在1.8～2.0。按照PrimeScripTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書進行逆轉錄，合成cDNA。以cDNA為模板對小鼠內參照β-actin及AQP1、AQP5基因進行PCR擴增。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，β-actin引物序列：上游為GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG，下游為ATGCCACAGGATTCCATACC；AQP1引物序列：上游為ACCTGFTGGCGATTGACTAC，下游為CACCTTCATGCGGTCTGTGA；AQP5引物序列：上游為GCTCCGAGCCATCTTCTACG，下游為GTGTTGTTGCTGAGCGCATT。實時熒光定量PCR反應是在美國伯樂公司的CFX型Real-Time熒光定量PCR儀上進行，建立10 μl反應體系，檢測內標基因β-actin及AQP1表達熒光強度達到設定區域時所經歷的循環數(Ct值)。以內標基因β-actin的Ct值為對照計算△Ct，以模型對照組為對照計算△△Ct，采用2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。

1.3統計學方法應用SPSS11.5軟件行單因素方差分析及χ2檢驗。

2結果

2.1當歸對陰虛哮喘小鼠支氣管激發中哮喘發作動物數的影響模型對照組吸入激發液后哮喘鼠數明顯增加(P<0.05，0.01)；經當歸治療后，哮喘鼠數下降，與模型對照組比較有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2當歸對陰虛哮喘小鼠肺液清除功能的影響哮喘早期的急性炎癥期，肺組織處于充血水腫狀態，水液含量高；哮喘中后期逐漸轉向以結締組織增生為主，肺組織間液逐漸減少。模型對照組小鼠肺組織濕重干重比明顯下降(P<0.01)；經當歸干預后，肺組織濕重干重比不同程度上升，其中高、中劑量組與模型對照組比較有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。此外，當歸中+地米組肺濕重干重比較高，與地塞米松組比較有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3當歸對陰虛哮喘小鼠肺組織中AQP1、AQP5蛋白表達水平的影響在高倍鏡下呈藍色顆粒者為AQP1、AQP5表達陽性細胞。小鼠肺組織AQP1主要表達于氣管腔上皮細胞、支氣管黏膜下腺上皮細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞及肺組織的血管內皮細胞；AQP5主要表達于肺泡Ⅰ型細胞的頂膜面、支氣管纖毛柱狀上皮細胞的頂膜面、黏膜下腺體、肺泡上皮細胞等部位。對肺組織AQP1、AQP5半定量分析顯示，模型對照組AQP1、AQP5的平均光密度明顯降低(P<0.01)；經當歸干預后，AQP1、AQP5的表達增強，與模型對照組比較有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見表2；圖1，圖2。

表1　當歸對陰虛哮喘小鼠支氣管激發中哮喘發作鼠數、

與模型對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與地塞米松組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

表2　當歸對陰虛哮喘小鼠肺組織中AQP1、AQP5蛋白表達

2.4當歸對陰虛哮喘小鼠肺組織AQP1、AQP5基因表達的影響每組隨機取6個標本進行實驗，PCR結果中基因擴增曲線和溶解曲線一致性較好，實驗具有可重復性。與正常對照組比較，模型對照組的AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達水平顯著下降(P<0.01)；經當歸干預后，AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達水平明顯上升，與模型對照組比較有統計學意義(P<0.01)。同時，與地塞米松組比較，當歸油中+地米組AQP1 mRNA與AQP5 mRNA表達水平上升的更明顯(P<0.05)，顯示出一定的協同作用。見表3。

A：正常對照組；B：模型對照組；C：地塞米松組；D：當歸高劑量組；E：當歸中劑量組；F：當歸低劑量組；G：當歸中+地米組；下圖同圖1　小鼠肺組織中AQP1表達水平的免疫組化分析(×40)

圖2　小鼠肺組織中AQP5表達水平的免疫組化分析(×40)

表3　當歸對陰虛哮喘小鼠肺組織AQP1 mRNA、

3討論

支氣管哮喘(簡稱哮喘)嚴重影響人們的生活質量〔6〕。盡管已經采取包括吸入糖皮質激素在內的綜合抗炎治療方案，但由于環境污染、人均壽命的延長，哮喘的發病率、死亡率并沒有隨之而降低〔5〕，仍然迫切需要去尋找新的方法來防治哮喘。自《神農本草經》記載當歸“主咳逆上氣”以來，歷代中醫典籍均有當歸防治呼吸系統疾病的理論與臨床應用。本次研究采用OVA與甲狀腺素復制慢性陰虛哮喘動物模型〔7〕，實驗結果顯示，當歸可明顯減少陰虛哮喘模型哮喘發作動物數，具有明顯的平喘作用。

當歸“主咳逆上氣”的中醫藥理論基礎是當歸具有補血養陰、活血行氣、布津潤燥的功效，而機體陰血津液的主要組成成分是水，所以當歸“主咳逆上氣”、防治哮喘的作用基礎是對肺臟水分的分布及伴隨而來的生理、病理功能的調節作用?，F代研究顯示，水通道蛋白對肺臟水分的分布及其功能的實現顯得尤為重要〔8〕。呼吸道和肺組織中的AQPs主要有AQP1、AQP5等，肺部AQP1主要分布于支氣管周圍血管床和淋巴管臟層胸膜，為血管與肺間質之間的水轉運快速通道，維持正常肺組織的通氣和換氣功能；AQP5在呼吸道和肺組織中分布最廣，主要參與構成血氣屏障氣體側的水分子通路，維持氣管與肺泡腔內的水代謝平衡，調節氣道液體的黏稠度〔9〕。本次實驗結果顯示，當歸可促進肺組織AQP1、AQP5及其基因的表達，提高陰虛型慢性哮喘的肺組織濕干重比值，促進肺水代謝平衡而實現肺組織水分的生理功能。

4參考文獻

1章辰芳，孔繁智.當歸對呼吸系統作用的研究概況〔J〕.中草藥，1999；30(4)：311-3.

2吳國泰，任遠，王鋒，等.當歸揮發油不同部位對豚鼠離體氣管平滑肌的作用及機制研究〔J〕.甘肅中醫學院學報，2011；28(4)：1-4.

3張君，駱仙芳，王會仍.肺水通道蛋白與支氣管哮喘〔J〕.中華哮喘雜志(電子版)，2013；7(1)：39-43.

4賀玉偉，柴程芝，寇俊萍，等.甲狀腺素誘導小鼠模型表觀指征變化與陰虛火旺證的相關性研究〔J〕.實驗動物科學，2013；30(2)：1-6.

5王志旺，孫少伯，王永輝，等.當歸揮發油對哮喘大鼠的平喘作用及其對IL-4、IFN-γ的影響〔J〕.免疫學雜志，2013；29(5)：391-4.

6李孟榮.變應性哮喘特異性免疫治療進展〔J〕.中華實用兒科臨床雜志，2012；27(16)：1226-9.

7馬子風，尹磊淼，冉君，等.小鼠過敏性哮喘模型制備的特點分析〔J〕.東南大學學報(醫學版)，2014；33(5)：650-5.

8Ablimit A，Hasan B，Lu W，etal.Changes in water channel aquaporin 1 and aquaporin 5 in the small airways and the alveoli in a rat asthma model〔J〕.Micron，2013；45：68-73.

9郭之強，顏春松.水通道蛋白與哮喘〔J〕.生命的化學，2010；30(5)：788-91.

〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

Effects of RASI on the expressions of aquaporin-1 and aquaporin-5 in lung of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome

LI Rong-Ke,LI Hai-Long,WANG Zhi-Wang,et al.

Gansu University of TCM,Lanzhou 730000,Gansu,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effects of Radix Angelicae Sinensis(RASI)on anti-asthma and the expressions of aquaporin-1(AQP1)and aquaporin-5(AQP5)in lung tissue of asthmatic mice with Yin deficiency syndrome.MethodsThe BALB/c mice were randomly divided into control,model,Dexamethasone,three doses of RASI,middle dose of RASI and Dexamethasone groups.Asthmatic model mouse was made by injecting ovalbumin(OVA)to sensitize,then inhaling OVA to stimulate,and thyroxin was used to make asthmatic mouse with Yin deficiency syndrome during late stimulation.The number of animals with asthma attacks,pulmonary fluid clearance,and expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue were observed.Results2,4 and 8 g/kg RASI could reduce the number of animals with asthma attacks,increase the ratio of W/D,and promote the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes in lung tissue(P<0.05,P<0.01).In addition,these was a certain synergy between RASI and dexamethasone on improving the expressions of AQP1 and AQP5 and their genes(P<0.05).ConclusionsOne of mechanisms of RASI's anti-asthmatic effect is to regulate the AQP1,AQP5 proteins and their genes expression to promote water metabolism balance in lung.

【Key words】Radix Angelicae Sinensis(RASI);Asthma with Yin deficiency syndrome;Aquaporin-1;Aquaporin-5

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81460668);甘肅省自然科學基金項目(No.1310RJZA086)

通訊作者：王志旺(1970-)，男，副教授，碩士，主要從事(中藥)藥理與毒理學教學與研究。

〔中圖分類號〕R285.5；R562.25

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)10-2309-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.001

1甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室

第一作者：李榮科(1972-)，男，副教授，碩士，主要從事中醫診治研究。