CTNNB1基因在卵巢癌組織中的表達及其相關性

劉海艷　王艷銘　王雨艷　劉麗麗　左中夫

(遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科，遼寧　錦州　121000)

·腫瘤·

CTNNB1基因在卵巢癌組織中的表達及其相關性

劉海艷王艷銘王雨艷劉麗麗左中夫

(遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科，遼寧錦州121000)

〔摘要〕目的分析CTNNB1在卵巢癌組織中的表達，探討其與臨床特征的關系。方法免疫組織化學方法檢測CTNNB1在正常卵巢上皮組織及卵巢癌組織中的表達，分析其與臨床特征間的關系；實時聚合酶鏈反應(PCR)法檢測CTNNB1 mRNA的表達；Western印跡法檢測CTNNB1蛋白的表達。結果正常的卵巢上皮組織未發現CTNNB1存在。在卵巢上皮性腫瘤組織中，93.3%的卵巢癌組織(42/45)出現了CTNNB1胞質表達。免疫組織化學染色結果顯示，CTNNB1主要定位于細胞質，表現為染色后胞質內可見棕褐色的粒狀物；CTNNB1在淋巴結轉移患者組織中的表達比無淋巴結轉移患者增加明顯，而不同年齡、病理分期、組織學分化程度間的表達差異不顯著；CTNNB1 mRNA和蛋白在卵巢癌組織及卵巢癌細胞株中表現為高表達，與正常的卵巢上皮組織差異顯著，其中在細胞株中CAOV3的表達最高。結論CTNNB1在卵巢癌組織及細胞株中均有高表達，且與卵巢癌淋巴結轉移關系密切。

〔關鍵詞〕CTNNB1；卵巢癌組織；細胞株

原發性卵巢癌是婦科較為常見惡性腫瘤，其發病機制不清，仍無有效治療手段。近年來大量文獻報道，CTNNB1基因表達增加在肝癌、結腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤形成過程中發揮了重要作用〔1～4〕。CTNNB1與腫瘤的發生發展關系密切，在肝癌、結腸癌、胃癌、肺癌等腫瘤組織中均可見CTNNB1蛋白表達增加〔5,6〕。但該基因在卵巢癌發生發展中的作用及分子機制仍不完全清楚。卵巢癌的發生發展及轉歸與多種因素密切相關，如TMN分期、淋巴結轉移、淋巴細胞浸潤及細胞分化等〔7〕。本課題擬探討CTNNB1基因的表達與卵巢癌TMN分期、淋巴結轉移、淋巴細胞浸潤及細胞分化程度之間的相關性。

1材料與方法

1.1標本與材料組織標本均來我院婦產科，包括10例正常的卵巢上皮組織及45例惡性卵巢上皮性腫瘤。其中惡性腫瘤中，黏液性囊腺癌21例，漿液性囊腺癌10例，透明細胞癌8例，內膜樣腺癌6例。年齡61～77歲，平均(69.8±8.6)歲。均來源于初次行探查手術的患者術中切除，排除探查術前接受過放化療及其他影響實驗研究的特殊處理者。正常的卵巢上皮組織均來源于子宮肌瘤或子宮內膜異位癥行子宮附件全切者。

1.2方法將每個腫瘤組織等分為二份，其中一份立即放于液氮中冰凍，另一份用4%甲醛溶液固定后石蠟包埋。人卵巢癌細胞株CAOV3，SKOV3，A2780由我院實驗室提供。

1.3免疫組織化學方法檢測CTNNB1的表達①切片：取石蠟包埋2 d后的標本進行連續切片，切片厚度保持在3 μm。②烤片：將空白切片放置于60℃烤箱中進行烤片，持續3 h，直至組織切片呈現透明。③脫蠟、水化：取二甲苯1、二甲苯2、無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇依次對經過烤片后的標本進行脫蠟、水化，分別為15 min，最后用蒸餾水沖洗3 min，共計5次。④孵育：利用新鮮配制3%過氧化氫溶液對其進行室溫孵育半小時，消除內源性過氧化物酶活性。磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3 min，共計5次。⑤抗原修復：處理后的標本切片放于枸櫞酸緩沖溶中，水浴15 min(95℃)，室溫下自然冷卻，蒸餾水沖洗5次；⑥封閉：10%山羊血清于37℃恒溫箱中，封閉15 min，甩去血清，切忌清洗。⑦加液：滴加鼠抗人CTNNB1抗體(溶液配比1∶100)在40℃下過夜，PBS沖洗5 min，總計5次。然后加入二抗(已進行生物素標記)，37℃恒溫孵育半小時，PBS沖洗3 min，共計5次。后滴加鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)，37℃恒溫孵育半小時，PBS沖洗3 min，共計5次。⑧顯色：滴加二氨基聯苯胺(DAB)液，顯色3 min，顯微鏡下觀察，當發現棕黃色顆粒后蒸餾水清洗，停止顯色反應，后用HE重復染色15 s后沖洗。⑨封片：常規梯度脫水，待標本干燥后采用中性樹膠進行封片，高倍鏡下觀察。

1.4實時聚合酶鏈反應(PCR)檢測CTNNB1 mRNA基因的表達采用SYBR Green方法檢測，反應體系：SYBR Green solution 12 μl；正向引物1 μl；負向引物1 μl；cDNA 2.0 μl；ddH2O 9 μl。共計25 μl。采用Trizol(購自美國GIBCO公司)提取總RNA，RT-PCR按照逆轉錄及PCR說明進行。引物序列為：CTNNB1：正義-TCCCACTCCTACGGAGAGAA，反義-GAAGGTCGGAAGGAAGG；內參基因β-actin：正義-GACCTGGAGACGAGTGTC，反義-TTCGCTCCACCTGTAAGTA。擴增條件為：95℃ 5 min→94℃ 15 s→60℃ 45s→75℃ 30 s，共計40個循環。實時PCR反應完成后，重復一個循環的溶解曲線反應，以評價擴增的特異性。待測基因CTNNB1的表達水平用2-ΔΔCT的方法進行統計。

1.5Western印跡法檢測CTNNB1蛋白的表達采用含10%胎牛血清(FBS)的細胞培養基(DMEM)進行培養。待卵巢癌細胞生長至80%融合時提取總蛋白。總蛋白的濃度采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白質定量試劑盒來進行測定。抗原抗體反應后進行顯色：取硝酸纖維素(NC)膜置于免疫印跡化學(ECL)發光劑中，反應3 min；暗室內曝光，常規方法定影，并利用 凝膠成像系統進行掃描顯色，采用光密度來對蛋白進行表達，蛋白的相對表達=目的蛋白/β-actin。

1.6結果判定由兩位醫師分別給予雙盲閱片，參照腫瘤的陽性細胞面積、染色強度來對結果進行計分。其中腫瘤的陽性細胞面積：陽性細胞面積為0不計分，1%～10% 1分，11%～49% 2分，50%～79% 3分，≥80% 4分；染色強度不表達為0分，弱表達(+)為1分，中度表達()為2分，強表達()為3分。兩者計分的乘積為最終的染色分級判斷標準。用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.7統計學方法采用SPSS18.0統計軟件包進行t檢驗，χ2檢驗，Pearson相關分析。

2結果

2.1免疫組織化學方法下CTNNB1在卵巢癌中的表達正常的卵巢上皮組織未發現CTNNB1存在。在卵巢上皮性腫瘤組織中，93.3%的卵巢癌組織(42/45)出現了CTNNB1胞質的表達。免疫組織化學染色結果顯示，CTNNB1主要定位于細胞質，表現為染色后胞質內可見棕褐色的粒狀物。見圖1。

圖1　CTNNB1 在正常卵巢上皮組織及卵巢癌組織中的表達(400×)

2.2CTNNB1表達與臨床病理的關系按年齡、病理分期、組織學分化程度、淋巴結轉移情況評分顯示，CTNNB1在淋巴結轉移患者組織中的表達比無轉移患者增加明顯(P<0.05)，而在患者不同年齡、病理分期、組織學分化程度間的表達差異無統計學意義，提示 CTNNB1的表達與卵巢癌的轉移有一定的相關性。見表1。

表1　CTNNB1表達與卵巢癌臨床病理特征之間的關系

2.3CTNNB1 mRNA和蛋白在卵巢癌組織表達CTNNB1 mRNA在卵巢癌組織及卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3、A2780中均為高表達，分別為6.1±0.0、5.0±0.1、4.2±0.1、3.5±0.0，明顯高于正常卵巢上皮組織(1.4±0.0)(P<0.001)。CTNNB1 蛋白在卵巢癌組織及卵巢癌細胞株CAOV3、SKOV3、A2780中均為高表達，分別為5.4±0.0、3.5±0.1、2.8±0.0、2.6±0.1，明顯高于正常卵巢上皮組織(1.1±0.1)(P<0.001)。見圖2、圖3。

圖2　CTNNB1 mRNA在卵巢癌組織中的表達

圖3　CTNNB1蛋白在卵巢癌組織中的表達

3討論

異常的Wnt信號傳導 被認為是卵巢癌變過程 的關鍵〔8～10〕。在激活Wnt通路的過程中，CTNNB1蛋白的穩定至關重要，這為卵巢癌的新治療提供了有力的靶位。CTNNB1基因也叫β-catenin基因，在癌細胞WNT信號傳導通路被激活 ，發揮抑制GSK-3β活性的作用，從而達到穩定CTNNB1蛋白的目的〔11～16〕。Wnt/β-catenin活化通路在人類多種腫瘤中均得到證實，而且研究還顯示，Wnt/β-catenin靶基因的活化可使腫瘤細胞發生侵襲和轉移、增殖等〔17～20〕。CTNNB1蛋白由于大量集聚在細胞質，能夠和T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)結合，轉入細胞核，進而激活其下游基因，加速細胞的增殖〔21～23〕。對卵巢癌細胞株的研究顯示，CTNNB1在部分細胞株中作為其必需的原癌基因，一旦CTNNB1的活性受限，細胞周期會很快停滯在G1期，細胞開始凋亡〔24～27〕。綜上，CTNNB1高表達于卵巢癌中，并且CAOV3是CTNNB1高表達的主要卵巢癌細胞株，推測在后續的研究中可以選擇CAOV3作為效應細胞來進一步驗證CTNNB1的功能及其在Wnt通路中的變化。

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〔2014-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：遼寧省教育廳科學技術研究項目(No.L2014332)

〔中圖分類號〕R737.31

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2675-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.049

第一作者：劉海艷(1979-)，女，碩士，主治醫師，主要從事老年病及臨床婦產科研究。