注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的適用性試驗探討

羅　丹（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司　沈陽　110027）

注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的適用性試驗探討

羅丹（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司沈陽110027）

按照《中華人民共和國藥典》（2015年版四部）通則1101無菌檢查法中適用性試驗的要求，采用薄膜過濾法，對注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的適用性試驗進行實驗室研究。研究發(fā)現(xiàn)，以80，000IU頭孢菌素酶作為中和劑，沖洗量為300mL，注射用頭孢噻肟鈉抑菌作用可以完全消除。可以采用薄膜過濾法對注射用頭孢噻肟鈉進行無菌檢查。

頭孢噻肟鈉 無菌檢驗 頭孢菌素酶

頭孢噻肟鈉（Cefotaxime Sodium，CTX）是第三代半合成頭孢類廣譜抗生素，對銅綠假單胞菌、不動桿菌、沙雷桿菌、某些厭氧球菌，以及部分脆弱擬桿菌等具有不同程度的抑制作用［1］。對嗜血桿菌的作用與第二代頭孢菌素產品接近，對大腸埃希菌及變型桿菌等頭孢菌素敏感的革蘭陰性菌也有較好的抑制作用［2］。

《中華人民共和國藥典》（2015年版四部）通則1101無菌檢查法要求，無菌制劑必須進行無菌檢查。在對具有抗菌活性藥品進行無菌檢查時，應首先消除其抗菌活性，并通過試驗驗證其抗菌活性去除是否徹底，保證檢驗結果的有效性。頭孢噻肟鈉對革蘭陰性菌有較強的抑菌作用，如何有效地去除抑菌作用，是其方法驗證的關鍵。通則1101無菌檢查法中提出為消除β-內酰胺類抗生素的抑菌性，采用薄膜過濾法可以加入中和劑β-內酰胺酶，去除殘留在濾膜上的頭孢菌素。本文作者對注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的驗證進行了實驗室研究，為將來對其建立系統(tǒng)的無菌檢查方法提供技術參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種：金黃色葡萄球菌Staphylococcu aureus CMCC（B）26003、大腸埃希菌Escherichia coli CMCC（B）44102、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis CMCC（B）63501、生孢梭菌Clostridium sporogenes CMCC（B）64941、黑曲霉 Aspergillus niger CMCC（F）98003、白色念珠菌Candida albicans CMCC（F）98001（均來自中國藥品生物制品檢定所）。

1.1.2培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號20151016，北京奧博星生物技術有限責任公司）、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號20160406，青島高科園海博生物技術有限公司）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號20150316，北京奧博星生物技術有限責任公司）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號1405072，北京三藥科技開發(fā)有限公司），靈敏度試驗均符合《中華人民共和國藥典》（2015年版四部）通則1101無菌檢查法規(guī)定。

1.1.3試劑及緩沖液：注射用頭孢噻肟鈉（批號150214，規(guī)格1.0g，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司），青霉素酶（批號：130441-201401，規(guī)格：3，000，000IU/mL，中國藥品生物制品檢定所），頭孢菌素酶（批號：20151204，規(guī)格：2，000，000IU/支，杭州北望生物技術有限公司），0.9%無菌氯化鈉溶液：氯化鈉9g，溶解于1L蒸餾水中。

1.1.4儀器及培養(yǎng)器：HTY-2000B型智能集菌儀及一次性全封閉集菌培養(yǎng)器KDGB330（杭州泰林生物技術設備有限公司）；培養(yǎng)箱（型號SHP-150，上海精宏試驗設備有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（型號DHG-9246A，上海精宏試驗設備有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（型號YXQ-LS-100SII，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2方法

1.2.1試驗菌懸液的制備：接種S.aureus CMCC（B）26003、B. subtilis CMCC（B）63501和E.coli CMCC（B）44102至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30℃～35℃恒溫培養(yǎng)18～24h；接種C.sporogenes CMCC（B）64941至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃恒溫培養(yǎng)18～24h；接種C.albicans CMCC（F）98001至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20℃～25℃培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液。接種A.niger CMCC（F）98003至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，20℃～25℃培養(yǎng)5～7d，加入5mL含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。然后，將孢子懸液移至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化鈉溶液制成每1mL含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。

1.2.2無菌檢查方法驗證試驗：試驗分為三組：①試驗組：取供試品30支，全部溶解于0.9%無菌氯化鈉溶液500mL中。按薄膜過濾法過濾，每個濾筒用pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液300mL沖洗，每次100mL，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌懸液，過濾。濾筒中分別加入100mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基；②陽性對照組：另取濾筒，加入同體積培養(yǎng)基，并接種等量的試驗菌，作為陽性對照；③陰性對照組：以等量的稀釋劑代替供試液，不接種試驗菌，其他操作同試驗組。其中，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基在30℃～35℃恒溫培養(yǎng)3d，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基在20℃～25℃恒溫培養(yǎng)5d，觀察結果［3］。

2　結果與分析

2.1不添加中和劑無菌檢查方法的適用性試驗：采用薄膜過濾法，不添加中和劑，對注射用頭孢噻肟鈉進行無菌檢查方法適用性試驗，陰性對照組結果均為陰性，試驗組結果見表1，陽性對照組結果見表2。

表1　不加中和劑無菌檢查方法適用性試驗—試驗組結果Table 1 Test group results of the sterility test method experiment with no neutralizer

表2　不加中和劑無菌檢查方法適用性試驗—陽性對照組結果Table 2 Positive control group results of the sterility test method experiment with no neutralizer

從表1和表2的結果可以看出，注射用頭孢噻肟鈉主要抑制E.coli CMCC（B）44102的生長，該菌為頭孢噻肟鈉的敏感菌株，所以添加中和劑進行頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的驗證試驗，只需選擇E.coli CMCC（B）44102作為試驗菌。

2.2添加中和劑無菌檢查方法的驗證試驗：另取供試品按“1.2.2”項下操作，以E.coli CMCC（B）44102作為試驗菌，分別添加300萬單位青霉素酶和8萬單位頭孢菌素酶作為中和劑（每100mL培養(yǎng)基），對注射用頭孢噻肟鈉進行無菌檢查方法的適用性試驗，陽性對照組結果為陽性，陰性對照組結果為陰性，試驗組結果見表3和表4。

表3　添加青霉素酶中和劑對大腸埃希菌無菌檢查方法適用性試驗—試驗組結果Table 3 Test group results of the sterility test method experiment with penicillinase as a neutralizer to E.coli CMCC（B）44102

表4　添加頭孢菌素酶中和劑對大腸埃希菌無菌檢查方法適用性試驗—試驗組結果Table 4 Test group results of the sterility test method experiment with cephalosporin enzyme as a neutralizer to E.coli CMCC（B）44102

從表3和表4的結果可以看出，加入頭孢菌素酶后無菌檢查方法的適用性試驗，每筒需要消耗沖洗液的體積為300mL，而加入青霉素酶則每筒則需要消耗800mL沖洗液，前者消除抑菌活性的作用優(yōu)于后者，故選擇加入頭孢菌素酶作為中和劑對注射用頭孢噻肟鈉進行無菌檢查。

3　討論

注射用頭孢噻肟鈉作為頭孢菌素類抗生素，具有較強的抑菌作用。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2015年版四部）通則1101無菌檢查法要求，對β-內酰胺類藥品進行無菌檢查時，可在樣品溶液、培養(yǎng)基或沖洗液中加入β-內酰胺酶消除抑菌性。

本文對注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查方法的適用性試驗進行了實驗室研究。研究發(fā)現(xiàn)，如果無菌檢查方法適用性試驗過程中沒有加入中和劑，敏感菌株大腸埃希菌被殘留的藥物活性成分抑制，無法正常生長。在驗證過程中加入青霉素酶和頭孢菌素酶后，發(fā)現(xiàn)二者均能不同程度消除抑菌。但通過試驗比較發(fā)現(xiàn)，頭孢菌素酶消除抑菌活性的效果優(yōu)于青霉素酶。前者不但使用量少，所用的沖洗量也減少，大大降低注射用頭孢噻肟鈉無菌檢驗的時間和成本，提高檢驗效率。

注射用頭孢噻肟鈉無菌檢查采用薄膜過濾法以E.coli CMCC（B）44102作為敏感試驗菌，沖洗液為pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，沖洗量為300mL，以每100mL培養(yǎng)基中加入8萬單位頭孢菌素酶作為中和劑，試驗組與陽性對照組比較均生長良好，說明頭孢噻肟鈉在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用可以忽略不計，按此方法對注射用頭孢噻肟鈉注射液進行無菌檢查所得結果準確、有效。同時，也說明各類注射用頭孢菌素類藥品的無菌檢驗方法可簡化、統(tǒng)一，形成標準操作規(guī)范。而其他各類藥品的微生物檢查方法，經長期大量的系統(tǒng)方法學研究，也可逐步規(guī)范、統(tǒng)一，成為藥品標準正文，至于目前缺少驗證方法造成的問題也將逐步得到解決。

［1］李晶，張美蕓，李全民.用鐵氰化鉀分光光度法測定頭孢噻肟鈉［J］.應用化學，2011，28（1）：88-93.

［2］張曄，徐峰，吳瑋峰.頭孢噻肟鈉在不同注射液中的穩(wěn)定性及抗菌活性研究［J］.中國醫(yī)藥導刊，2014，16（6）：1097-1098.

［3］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）［S］.北京，中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

R978.1+1

B

1672-8351（2016）09-0129-03