抗纖軟肝膠囊對肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

劉黎明　張建軍　胡東輝

(湖北中醫藥大學，湖北　武漢　430065)

抗纖軟肝膠囊對肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

劉黎明張建軍1胡東輝1

(湖北中醫藥大學，湖北武漢430065)

〔摘要〕目的探討抗纖軟肝膠囊對肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響。方法66只雄性Wistar大鼠，隨機數字表法中選取66個數字依大小排列，前12個為正常組，中36個為模型組，后18個為干預組，通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)法制備大鼠肝纖維化模型，應用蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson三色染色觀察肝組織形態變化，免疫組化法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達。結果三組羥脯氨酸(Hyp)含量差異顯著(P<0.05)，其中模型組和干預組高于正常組，模型組高于干預組(P<0.05)。免疫組化染色顯示Bax蛋白主要分布在肝細胞質、Bcl-2蛋白主要分布在肝纖維間隔和匯管區。三組Bax、Bcl-2蛋白表達差異顯著(P<0.05)，其中正常組和干預組低于模型組，正常組低于干預組(P<0.05)，三組Bax/Bcl-2比值統計學差異(P>0.05)。結論抗纖軟肝膠囊可能降低肝細胞Bax和Bcl-2蛋白表達，減輕肝損傷。

〔關鍵詞〕抗纖軟肝膠囊；肝纖維化；Bax；Bcl-2蛋白

肝纖維化是各種慢性肝病的病理基礎，由各種致病因子導致肝內結締組織異常增生，文獻顯示肝纖維化嚴重程度與肝細胞凋亡增加，星狀細胞活化增加、凋亡減少相關聯〔1〕。B細胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)、Bax蛋白的表達變化決定了肝細胞、肝星狀細胞(HSC)凋亡，進而影響纖維化的進程〔2〕。抗纖軟肝膠囊是一種中藥制劑，研究發現可能在肝纖維化治療方面具有一定效果〔3〕。本文旨在研究抗纖軟肝膠囊對肝纖維化大鼠肝組織Bax和Bcl-2蛋白表達的影響。

1資料與方法

1.1動物及分組選取清潔級Wistar雄性大鼠66只，購自武漢大學動物實驗中心，合格證書：醫動字第09-012號，體重180～200〔平均(190.58±2.35)〕g，同時購買配套大鼠飼料4袋。將所有大鼠用數字編號，隨機數字表法選取66個數字，按照大小排列，前12個為正常組，中36個為模型組，后18個為干預組。

1.2試劑及藥物500 ml精制四氯化碳(CCl4)試劑購自歐陸科儀(中國)有限公司，橄欖油購自中國蘇格拉蒂橄欖油有限公司，Bcl-2抗體和Bax 抗體均購自英國艾美捷科技有限公司，SASC(Strept Avidin-Biotin Complex)試劑盒購自武漢博士德生物制品公司，大鼠羥脯氨酸(Hyp)試劑盒購自上海酶聯生物研究所。抗纖軟肝膠囊購自湖北省中醫院(鄂藥制字Z20113151，成分：土鱉蟲10 g，鱉甲10 g，茵陳蒿20 g，丹參30 g，三七6 g，桃仁10 g，當歸10 g，莪術10 g，炮山甲6 g，白術10 g，薏苡仁20 g，黃芪10 g。

1.3研究方法

1.3.1動物肝纖維化模型制備和肝標本制備Wistar雄性大鼠66只,正常喂養1 w，正常組等滲鹽水腹腔注射(0.2 m1/100 g)，2次/w，共8 w，同時按每100 g體質量2 ml給予等滲鹽水灌胃，1次/d，共8 w，觀察至14 w；模型組和干預組以30%CCl4橄欖油溶液(0.2 ml/100 g)腹腔注射，2次/w，共8 w，CCl4造模同時按每100 g體質量2 ml給予等滲鹽水灌胃，1次/d，共8 w，停CCl4觀察至14 w(逆轉6 w)，其中干預組造模同時按大鼠體質量2 ml/100 g給予含抗纖軟肝膠囊生藥0.046 g/ml藥液灌胃，1次/d，共8 w。干預組分別于第4、6、8周末隔夜空腹處死大鼠各6只；正常組和模型組分別于第4、6、8、10周(逆轉2 w)、12 w(逆轉4 w)、14 w(逆轉6 w)末隔夜空腹處死正常組各2只、模型組各6只大鼠，留取血清；迅速取部分肝組織以4%中性甲醛固定，用于肝組織病理及免疫組織化學染色觀察。

1.3.2肝組織Hyp測定和組織學觀察精確稱取肝臟組織濕重30～100 g放入試管中，加入水解液1 ml，混勻加蓋后95℃水解20 min，配置肝組織水解液，調節pH值6.0～6.8，同時設定空白管、標準管等，嚴格按照試劑盒要求步驟操作。

取適量大鼠肝組織，10%甲醛固定，石蠟包埋，制作肝臟組織切片，利用蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson三色染色，倒置顯微鏡10倍下觀察細胞形態或者改變等，并且觀察肝纖維化情況。

1.3.3Bax和Bcl-2蛋白表達測定將經過石蠟包埋肝組織進行切片，厚度5 μm，然后進行Bax和Bcl-2免疫組化染色和SABC法顯示Bax和Bcl-2蛋白分布，按照SABC試劑盒要求步驟嚴格進行。光鏡下觀察肝組織病變、Bax和Bcl-2蛋白表達分布，免疫組化染色陽性出現棕黃色顆粒和線性沉積于細胞質、間隔等，Bax和Bcl-2蛋白陽性表達以已確診Bcl組織為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液(PBS)為一抗陰性對照，每張切片選取5個視野(400倍)，利用形態分析軟件分析陽性面積所占比例，取平均值。

1.4統計學方法應用SPSS13.0軟件進行方差分析和LSD-t檢驗。

2結果

2.1肝組織Hyp測定和組織學觀察正常組Hyp為(0.23±0.08)μg/ml，模型組為(0.45±0.21)μg/ml，干預組為(0.32±0.06)μg/ml，差異顯著(F=3.565，P=0.035)，其中模型組和干預組均高于正常組(t=4.564、3.342,P=0.021、0.038)，模型組高于干預組(t=3.876，P=0.032)。

組織學觀察：HE染色顯示正常組織結構清楚，細胞形態完整，無明顯凋亡現象；模型組組織結構破壞，肝細胞脂質變性，具有明顯纖維組織增生；干預組組織結構受到破壞，肝細胞脂質變性，纖維組織增生，但是均無模型組嚴重。Masson三色染色顯示正常組僅顯示少量藍色纖維；模型組藍色纖維明顯增加，并且相互交織形成纖維間隔；干預組藍色纖維有所減少，纖維多分布與血管周圍和匯管區。

2.2Bax和Bcl-2蛋白表達免疫組化染色顯示Bax在正常組肝組織中央靜脈以及肝竇少量表達，為淺棕黃色；模型組主要在肝細胞質呈現深棕黃色，在肝纖維間隔和匯管區淺黃色。Bcl-2在正常組細胞質、中央靜脈底表達，為淺棕黃色；在肝纖維間隔和匯管區高表達，為深棕黃色。三組Bax、Bcl-2蛋白表達差異顯著(P<0.05)，其中正常組和干預組均低于模型組，正常組低于干預組(P<0.05)，三組Bax/Bcl-2比值差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　三組Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較

與模型組相比：1)P<0.05，與正常組相比：2)P<0.05

3討論

肝纖維化是一個病理生理過程，是指由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生〔4〕。任何肝臟損傷在肝臟修復愈合的過程中都有肝纖維化的過程，如果損傷因素長期不能去除，纖維化的過程長期持續就會發展成肝硬化，嚴重損傷肝臟功能〔4〕。肝纖維化是肝臟損傷、肝臟炎癥、肝細胞壞死、HSCs激活等的中心環節〔5〕。HSCs是肝臟的一種非實質細胞，位于Disse間隙內，是肝纖維化時大量細胞外基質(ECM)及膠原過多產生的主要來源細胞，其激活和增殖在肝纖維化發生過程中起關鍵作用〔6〕；靜止的HSCs被激活后大量增殖，表達各種細胞外信號轉導通路蛋白〔7〕；分泌大量細胞因子、產生金屬蛋白酶抑制物，誘導生成〔8〕；若病因持續存在，導致肝小葉結構和血液循環異常，誘發肝硬化發生。目前肝移植是嚴重肝病唯一有效的治療措施，但肝纖維化在某種程度上可逆轉，抑制HSCs 激活、促進其凋亡，是肝纖維化恢復的主要機制。

肝細胞凋亡主要有內源性途徑和外源性途徑〔9〕，這兩種途徑都伴隨著線粒體結構和功能的改變，調節肝細胞發生凋亡的重要蛋白為Bcl-2家族。Bcl-2和Bax分別作為Bcl-2家族中抗凋亡和促凋亡的代表蛋白，在細胞凋亡機制中起著重要作用〔10〕。Bax誘導細胞凋亡表達與定位改變相關，正常細胞中Bax主要定位于細胞質內〔11〕，受到損傷后，Bax將重新定位，促使線粒體孔道形成，引起細胞色素C的釋放，從而誘導細胞凋亡。細胞凋亡時，Bax通過破壞線粒體膜的完整性發揮作用，而Bcl-2則在線粒體外膜發揮作用，以維持膜的完整性。

Hyp在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中含量極少，其他蛋白中基本不存在，膠原蛋白大多分布在皮膚、腱、軟骨、血管等處，因此Hyp可以較好反映結締組織疾病的膠原代謝情況。本研究結果說明給予干預大鼠抗纖軟肝膠囊后大鼠肝細胞過度凋亡情況有所改善，并且Bcl-2蛋白表達降低，可以誘導HSCs凋亡等。抗纖軟肝膠囊進入可能激活線粒體依賴凋亡途徑，促使線粒體膜電位降低，促使Bcl-2家族蛋白活化，通過導致Bax、Bcl-2蛋白表達降低發揮作用。抗纖軟肝膠囊可能通過降低肝細胞Bax和Bcl-2蛋白表達途徑，尤其是在肝細胞質、纖維間隔、匯管區等區域Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax表達水平動態變化的影響，減少肝細胞凋亡和促進HSC細胞凋亡，減輕肝損傷，為研究抗肝纖維化的作用機制、臨床治療提供理論依據。

4參考文獻

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〔2015-06-24修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：湖北省2011年度科研項目(No.JX5B39)

通訊作者：胡東輝(1984-)，男，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合肝病方面的研究。

〔中圖分類號〕R57

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2615-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.021

1湖北省中山醫院肝病科

第一作者：劉黎明(1981-)，男，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合肝病方面的研究。