金絲草提取物對(duì)急性腎衰竭大鼠腎組織中載脂蛋白M的表達(dá)及NF-κB抑制劑的干預(yù)作用

李元寧

(青海省紅十字醫(yī)院腎內(nèi)科，青?！∥鲗帯?10000)

金絲草提取物對(duì)急性腎衰竭大鼠腎組織中載脂蛋白M的表達(dá)及NF-κB抑制劑的干預(yù)作用

李元寧

(青海省紅十字醫(yī)院腎內(nèi)科，青海西寧810000)

〔摘要〕目的金絲草提取物對(duì)急性腎衰竭(ARF)大鼠腎組織中載脂蛋白(Apo)M的表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抑制劑的干預(yù)作用。方法雄性Wistar大鼠76只，7～10周齡，體重(200±30)g,分為模型組18只、金絲草組19只、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTF)組19只及對(duì)照組20只。以摘除右腎，結(jié)扎左腎動(dòng)脈血流建立ARF模型，從造模成功后第2天開(kāi)始，金絲草組按80 mg/kg 腹腔注射金絲草水提物；PDTF組腹腔注射NF-κB抑制劑PDTF 100 mg/kg，模型組和對(duì)照組均腹腔注射等體積的蒸餾水,1次/d,連續(xù)8 w。模型組和對(duì)照組均以等體積的蒸餾水灌胃,1次/d,連續(xù)8 w。觀察腎組織病理改變并測(cè)定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量，Western印跡法檢測(cè)ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)水平。結(jié)果治療后各組SCr、BUN水平、ApoM、NF-κB蛋白除模型組的外均明顯下降(P<0.05)，與PDTF組相比金絲草組下降更為明顯(P<0.05),且ApoM與NF-κB的表達(dá)符合直線正相關(guān)(r=0.838，P<0.01)。病理切片顯示金絲草組可見(jiàn)極少炎性細(xì)胞，腎臟病變比PDTF組明顯減輕。結(jié)論金絲草提取物及NF-κB抑制劑能夠明顯降低ARF大鼠腎組織中ApoM的表達(dá)水平。

〔關(guān)鍵詞〕金絲草提取物；急性腎衰竭；載脂蛋白M；核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制劑

急性腎衰竭(ARF)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)〔1〕，且死亡率高，目前主要靠早期血液透析治療,但給患者造成痛苦且儀器設(shè)備昂貴〔2〕。有研究顯示金絲草對(duì)ARF確有相應(yīng)的輔助治療作用〔3〕，能夠有效降低ARF大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)含量，延緩腎臟衰竭病程進(jìn)展〔4〕，但相關(guān)報(bào)道尚少。本文通過(guò)觀察ARF大鼠腎組織中載脂蛋白(Apo)M的表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抑制劑的干預(yù)作用來(lái)探究金絲草提取物對(duì)ARF的治療作用。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠80只，7～10周齡，體重(200±30)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2儀器及試劑金絲草水提物、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTF)(Sigma公司)，BUN、SCr血清生化檢測(cè)試劑盒(生化試劑公司)，自動(dòng)生化分析儀(日立750日本)，ApoM兔抗人多克隆抗體(瑞典隆德大學(xué)臨床化學(xué)研究所)，NF-κB兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型的建立隨機(jī)選取60只大鼠，用1%戊巴比妥鈉(3 ml/kg 體重)腹腔注射麻醉，剪毛，消毒后腹部正中切口， 分離雙側(cè)腎臟，摘除右腎，暴露左側(cè)腎臟,結(jié)扎左上支和中支腎動(dòng)脈血流45 min，灌注24 h復(fù)制ARF模型大鼠。對(duì)照組只切除右腎，對(duì)左腎不做處理，縫合切口。腹腔注射青霉素,連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

1.3.2分組和用藥60只造模大鼠因麻醉死亡1只，由于ARF死亡3只，余下56只大鼠隨機(jī)分為模型組18只、金絲草組19只及PDTF組19只。從造模成功后第2天開(kāi)始，金絲草組按8 mg/kg腹腔注射金絲草水提物；PDTF組腹腔注射NF-κB PDTF，模型組和對(duì)照組均腹腔注射等體積的蒸餾水,1次/d,連續(xù)8 w。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及觀察方法

1.4.1SCr、BUN含量測(cè)定各組大鼠開(kāi)腹，下腔靜脈取血3 ml，使用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠的SCr、BUN水平。

1.4.2Western印跡法檢測(cè)ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)切除左腎,迅速分離60 mg腎皮質(zhì),冰上勻漿,抽提胞質(zhì)蛋白和核蛋白,BCA法定量，分離膠濃度12%,濃縮膠濃度6%，電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，Ⅰ抗(ApoM兔抗人多克隆抗體，濃度1∶10 000、NF-κB兔抗大鼠多克隆抗體，濃度1∶800),Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔，濃度1∶2 000),孵育1.5 h后洗膜，按照化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒說(shuō)明進(jìn)行化學(xué)發(fā)光,最后用凝膠成像系統(tǒng)自動(dòng)曝光、掃描。

1.4.3腎組織病理學(xué)檢查取各組大鼠腎組織，10%中性甲醛固定24 h,脫水、透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋，制備石蠟切片,蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎臟病理改變。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1模型驗(yàn)證造模后第3天開(kāi)始造模大鼠出現(xiàn)進(jìn)食量逐漸減少，精神萎靡不振，瞇眼，豎毛拱背，眼瞼浮腫，畏寒怕冷，活動(dòng)量減少，毛色干枯；第6天開(kāi)始尿量減少，體重明顯減輕，出現(xiàn)個(gè)別死亡如生命質(zhì)量下降。尾部取血3 ml，離心后檢測(cè)其SCr〔(90.93±12.45)μmol/L〕、BUN〔(38.82±9.81)mmol/L〕含量與對(duì)照組〔(62.73±11.32)μmol/L、(7.43±2.38)mmol/L〕相比有明顯差異(P<0.05)，證明造模成功。

2.2各組大鼠SCr、BUN水平比較與對(duì)照組相比,ARF模型組大鼠的SCr、BUN水平明顯升高,治療后治療各組SCr、BUN水平均下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與PDTF組相比，金絲草組SCr、BUN水平下降更為明顯(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1　治療前后各組大鼠SCr、BUN水平比較

與模型組相比：1)P<0.05，與PDTF組相比：2)P<0.05；下表同

2.3各組大鼠ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)水平及相關(guān)性分析與對(duì)照組相比,ARF模型組大鼠的ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，治療后治療各組ApoM、NF-κB蛋白水平均下降，與模型組相比，差異顯著(P<0.05)，與PDTF組相比，金絲草組ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)下降更為明顯(P<0.05),見(jiàn)表2。且ApoM與NF-κB的表達(dá)符合直線正相關(guān)(r=0.838，P<0.01)。

表2　各組大鼠ApoM、NF-κB蛋白表達(dá)水平比較

2.4腎組織病理學(xué)改變腎組織學(xué)檢查可見(jiàn),對(duì)照組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，模型組鏡下見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、壞死,管腔內(nèi)各種管型,腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，PDTF組有少量炎性細(xì)胞;金絲草組可見(jiàn)極少炎性細(xì)胞，腎臟病變比PDTF組明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖2　各組大鼠腎組織病理圖片

3討論

ARF是以急性腎小管壞死為特征的臨床重危病癥,死亡率極高。中醫(yī)學(xué)中雖無(wú)“急性腎功能衰竭”一詞,但《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有“關(guān)格”、“癮閉”、等近似病證〔5〕。從大量的古代文獻(xiàn)中,可找到類似腎功能衰竭的描述?！端貑?wèn)·宣明五氣篇》就有“膀膚不利為癮”的記載〔6〕?！端貑?wèn)·奇病論》中的“有病龐然如有水狀,切其脈大緊,身無(wú)痛者,形不瘦……,病生在腎,名為腎風(fēng),腎風(fēng)而不能食,善驚,驚己,心氣萎者死?！鳖愃朴谀I衰的消化、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀〔7〕?，F(xiàn)代研究顯示，ApoM是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型Apo,在1999年首次被鑒定和分離，在血漿中主要存在于高密度脂蛋白(HDL),也存在于低密度脂蛋白(LDL)和脂肪餐后的富含甘油三酯脂蛋白(TRL)〔8〕,其生理功能尚未完全闡明。ApoM僅在肝臟和腎臟,腎臟近曲小管ApoM的高表達(dá),提示ApoM在分泌和重吸收尿液過(guò)程中的物質(zhì)代謝方面具有一定的生理學(xué)作用，因此其表達(dá)水平的高低可以反映腎衰程度〔9〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB是真核細(xì)胞中普遍存在的一種轉(zhuǎn)錄因子。一般以非活化的狀態(tài)存在,當(dāng)細(xì)胞受到刺激因子刺激時(shí),NF-κB被激活,轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,與細(xì)胞因子、細(xì)胞黏附分子等反應(yīng)基因位點(diǎn)結(jié)合〔10〕,因此在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、凋亡等方面起到了關(guān)鍵作用〔11〕。因此,NF-κB已成為腫瘤、炎癥等疾病新的治療策略。

本研究表明金絲草提取物和NF-κB抑制劑均能改善SCr、BUN水平，且PDTC能夠通過(guò)降低腎臟的NF-κB水平改善腎組織的SCr，BUN水平，緩解ARF癥狀，達(dá)到治療ARF的目的。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-08-11修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號(hào)〕R692.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2619-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.023

第一作者：李元寧(1976-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腎病內(nèi)科研究。