不同氮形態對龍葵鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響

楊容孑，劉柿良，宋會興，楊亞男，潘遠智

四川農業大學風景園林學院，四川 成都 611130

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不同氮形態對龍葵鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響

楊容孑，劉柿良，宋會興，楊亞男，潘遠智*

四川農業大學風景園林學院，四川 成都 611130

摘要：以鎘超積累植物龍葵（Solanum nigrum L.）為材料研究了不同氮形態對其鎘（Cd）積累的影響及其生理響應機制，為今后利用龍葵進行植物冶金和鎘污染土壤修復提供理論依據。采用龍葵室內盆栽控制試驗，采用不同濃度3種氮形態［銨態氮（NH4）2SO4、硝態氮NaNO3、硝態-銨態氮NH4NO3］處理，以植株生長為重要參考，研究其對鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響。結果表明，（1）鎘（10～160 mg·kg-1）顯著影響龍葵生長，降低生物量積累；外施3種形態氮均能緩解40 mg·kg-1鎘毒害，提高地上部生物量、葉綠素含量和鎘累積量，且銨態氮對生物量增產與鎘累積效果優于其他形態氮肥，其中400 mg·kg-1的NH4SO4最為明顯。（2）植株葉片過氧化氫（H2O2）水平隨施銨態氮和銨態-硝態氮量增加而降低，隨施硝態氮量增加而先降后升。（3）過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）隨施硝態氮與硝態-銨態氮濃度增加而減低，超氧化物歧化酶（SOD）活性隨施硝態氮量增加先升后降；POD活性隨施加銨態氮濃度增加而逐漸升高，顯示銨態氮能顯著提升幼苗抗氧化能力。（4）隨硝態氮施加量增加，硝酸還原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性先升后降；而GS活性在銨態氮施加量為100 mg·kg-1時達到最大，隨后逐漸降低。同時，谷氨酸脫氫酶（GDH）活性隨著3種不同形態氮施加量的增加逐漸降低。從植物修復角度出發，銨態氮對龍葵的強化修復效果優于硝態氮與硝態-銨態氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+為龍葵鎘修復的最佳濃度。

關鍵詞：龍葵；氮形態；鎘脅迫；氮同化；抗氧化系統

引用格式：楊容孑，劉柿良，宋會興，楊亞男，潘遠智.不同氮形態對龍葵鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響［J］.生態環境學報，2016，25（4）:715-723.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi.Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:715-723.

近年來，土壤重金屬污染已成為危害人類健康的重大因素（劉柿良等，2013；張永平等，2014；Liu et al.，2016）。植物修復技術，尤其利用超積累植物（Hyperaccumulators）對土壤重金屬進行植物提取，已被認為是成本最低且對環境無二次污染的友好型治理技術（Wang et al.，2008）。然而，目前發現的大多數超積累植物生長緩慢，生物量較小（劉柿良等，2014；Liu et al.，2015；李虹穎等，2016），修復效率低且不適宜大面積使用，從而限制了該技術的應用和推廣。同時，植物吸取修復效率與土壤污染物濃度及其有效性相關，即污染物濃度越高，修復效率越低（胡鵬杰等，2014）。研究表明，通過增施肥料、土壤改良等農藝措施可提高修復植物生長速度、生物量及重金屬積累量（Xu et al.，2010；Li et al.，2014），是提高植物修復效率最有效手段之一。

土壤-植物系統中，氮（N）素是植物必需“生命元素”和生長限制元素（Vitousek et al.，2010；張敏等，2013；陳久耿等，2014）。氮肥作為最常用的化肥，在提高作物產量、改善品質和培肥地力等方面作用顯著（Maier et al.，2002；張敏等，2013；張永平等，2014）；且能影響植物生物分配格局，以及土壤重金屬生物有效性和植物對重金屬的吸收能力（胡鵬杰等，2014；劉柿良等，2015）。因此，通過合理施用氮肥，提高重金屬污染土壤的修復效率，是目前植物修復的重要強化措施之一。研究表明，隨氮肥用量的增加，土壤鎘的生物有效性提高，但不同形態氮肥對其影響差異顯著（Maier etal.，2002）。例如，施用銨態氮肥（NH4+-N）降低鉛（Pb）對魚腥草（Houttuynia cordata）的毒害，促進玉米（Zea mays）對重金屬的吸收；硝態氮肥（NO3--N）則利于Pb2+由魚腥草根部向上轉移（樓玉蘭等，2005；楊剛等，2007），其原因是由于不同形態氮對植物生長的表型影響不盡相同（楊剛等，2007）。目前，有關氮肥對超積累植物重金屬積累及氮同化的影響極少報道，其對植物的調節機理也尚未明了。

龍葵（Solanum nigrum L.）是我國新近發現的鎘超積累植物（Wei et al.，2004），不僅生物量大，對土壤鎘具超積累特性，且具有多年生、無性繁殖、適于刈割的特點，是實施植物修復和研究植物超積累機制的優良材料。然而，目前對優化龍葵修復效率的農藝措施研究不多，施用不同形態氮對鎘積累的促進作用及其機理也尚未報道。因此，本文通過盆栽控制試驗，比較研究不同形態氮肥對龍葵幼苗鎘積累、抗氧化系統和氮同化的影響，以期為龍葵進一步開發和利用提供科學依據，對推動重金屬污染土壤的植物修復技術的應用推廣具有重要意義。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試龍葵種子由北京醫科院藥用植物研究所提供。試供土壤采于四川農業大學成都校區實驗基地（103o51'E，30o42'N）周邊自然土壤［黃壤（紫色土），即園土］，不含腐葉根，采樣深度為表層0～20 cm；發酵土由成都溫江區花木交易中心提供。氮肥為：銨態氮［（NH4）2SO4］、硝態氮（NaNO3）、硝態-銨態氮（NH4NO3），不含結晶水；試驗試劑為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O），均為分析純。

1.2試驗方法

2014年6月中旬，將采集的園土自然風干、搗碎、剔除雜物，研磨，過5 mm篩。按1∶1（W/W）將發酵土和園土均勻混合成試驗種植土，在干燥的實驗室堆積靜置45 d。然后將種植土（干土）按照每盆5.00 kg標準統一裝入帶托盤塑料花盆。將裝有種植土的塑料花盆置于實驗大棚，用不含鎘等干擾物質的柱層析去離子水控制土壤含水量為田間持水量的60%。種植土（園土+發酵土）的基本理化性質為：pH值6.8，全氮（N）0.73 g·kg-1，全磷（P）0.38 g·kg-1，全鉀（K）3.76 g·kg-1，有機碳（C）32.92 g·kg-1，總Cd為0.419 mg·kg-1。

2014年8月15日，將龍葵種子消毒后播種于穴盤。待幼苗長出4片真葉時，挑選健壯且長勢一致的植株移栽至塑料花盆，每盆3株，種植深度1.5～2.0 cm。植物恢復生長后，于2013年9月29日開始鎘處理。根據國家土壤環境質量標準和四川盆地重金屬污染發展概況，以不添加鎘作為對照，鎘處理水平為：10、20、40、80和160 mg·kg-1（不含背景值，以Cd2+計），每處理3次重復。按預先設置水平于每盆中添加Cd2+，添加方法為以分析純CdCl2·2.5H2O與去離子水配制成500 mL溶液均勻施入塑料盆（滲出液反復回收澆灌）。2014年10月1日收獲不同處理下的龍葵植株，測定植株根長、株高及各器官干重，獲得最佳鎘脅迫濃度以進一步試驗。

2014年10月5日，按照上述方法處理種植土和試供植物。待植物恢復生長后，以固體形式施加氮肥和鎘（最佳濃度）。試驗中，3種形態氮素的處理水平分別設定為：0［CK］、25［N25］、50［N50］、100［N100］、200［N200］、400［N400］ mg·kg-1（干土）。為保證最終施入土壤的氮量相同，施加硝態氮（NO3+-N，NaNO3）量分別為：795、1590、3180、6360和12720 mg；銨態氮［NH4+-N，（NH4）2SO4］量為：590、1180、2360、4720和9440 mg；硝態-銨態氮［NO3+/NH4+-N，NH4NO3］為：357、714、1428、2856和5712 mg。2014年11月7日收獲不同處理龍葵植株，蒸餾水數次洗凈（根系在20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液中浸泡15 min），待測。測定均重復3次。

試驗中，精心養護管理，視植物的生長情況澆水，澆水時將溢出的水倒回盆內。同時，若盆內有雜草應及時拔掉放回盆中，減少水分與養分的流失。為避免其他物質影響結果，試驗中不噴施農藥，不追施化肥。該試驗大棚中透光率為80%，溫度（26±3）℃，室內外溫度接近，平均相對濕度約為70%。

1.3測定方法

選取不同處理下幼苗，采用游標卡尺測量根長（主根長）、基徑和株高。同時，參照李合生等（2000）方法測定葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）含量，計算總葉綠素（Chl）及葉綠素a/b（Chla/b）。同時，樣品分為地上部（葉、莖和果）和地下部（根系）。105 ℃烘箱內殺青30 min，再在75 ℃下烘干至恒重，計算單株生物量。

植物組織中Cd測定。稱取0.1 g樣品在電爐上炭化，后在550 ℃馬福爐中干灰化6 h，5 mL 6 mol·L-1HCL溶解，過濾，0.1 mol·L-1HCL定容至50 mL，使用火焰原子吸收光譜儀（SHIMADZU AA-6300，Kyoto，Japan）測定Cd（李虹穎等，2016）。

取0.2 g新鮮葉片置于預冷研缽中，加入5 mL預冷50 mmol·L-1磷酸緩沖液（pH 7.8）研磨，然后用磷酸緩沖液（PBS）定容至10 mL在4 ℃下離心15 min（10000×g），取上清液并測定過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量。MDA含量測定采用Cakmak et al.（1992）方法測定；H2O2含量測定參照Patterson et al.（1984）方法。同時，參照李合生等（2000）方法采用紫外吸收法測定CAT活性，3 mL反應體系中含有50 mmol·L-1PBS和10 μL 30% H2O2，加入0.1 mL酶液啟動反應（不加H2O2為對照），反應5 min后測?240降低速率，每分鐘?240降低0.01定義為1個酶活力單位［U/（g·min-1）］。同時，采用愈創木酚法測定POD活性（1），采用氮藍四唑光化還原法測定SOD活性（2），其計算公式分別為：

其中，?470為反應時間內吸光值變化；WF（g）為材料鮮重；T（min）為反應時間；VT（mL）為提取酶總體積（mL）；VS（mL）為取用酶液體積。

其中，A1為照光對照管吸光度；A2為樣品管吸光度；V（mL）為樣品液總體積；Vt（mL）為測定樣品用量；W（g）為鮮重。

參照Nagalakshmi et al.（2001）方法，采用巰基試劑2-硝基苯甲酸（DTNB）測定還原型谷胱甘肽（GSH）含量。取1.0 g樣品，加入3 mL 3%的三氯乙酸（TCA）研磨勻漿離心（10000×g，20 min），取上清液1 mL于試管中，加入2 mL 150 mmol·L-1NaH2PO4溶液（pH 7.7），混合后加入DTNB試劑（39.6 mg DTNB溶解于10 mL 0.15 mol·L-1PBS，PBS溶液 pH=7.0），5 min后測定?412吸光度。

參照Wallace et al.（1965）的方法測定硝酸還原酶（NR）活性。取鮮樣0.5 g，向對照試管中加入1.0 mL 30% TCA溶液，再向各試管加入9.0 mL 0.1 mol·L-1KNO3溶液，抽氣1 h，25 ℃暗反應30 min后加入1.0 mL 30% TCA、2.0 mL 1%磺胺溶液和2.0 mL 0.02%萘胺溶液顯色20 min，540 nm下比色。同時，稱取0.5 g預冷鮮樣，加入4.0 mL 0.05 mol·L-1pH 7.4的磷酸緩沖液（含0.4 mol·L-1蔗糖、4 mmol·L-1L-半胱氨酸）于研缽，10000×g離心10 min，上清液用于酶活性測定。采用Kaiser et al.（1984）方法測定谷氨酰胺合成酶（GS）活性；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性測定采用Singh et al.（1986）方法。

1.4數據分析

數據采用SPSS 17.0軟件統計分析，單因素方差檢驗（One-way ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）檢驗，Microsoft Excel 2013制表作圖。顯著性水平設定為α=0.05。數據表達方式為：平均數±標準差。

2　結果與分析

2.1鎘對龍葵幼苗生長及生物量的影響

株高和基徑粗是植物生長的重要指標。表1顯示，根長與基徑均隨鎘脅迫濃度的增大而先升高后降低，在10、20或40 mg·kg-1鎘處理時達到最大；而株高則在20 mg·kg-1鎘處理時達最大值，160 mg·kg-1鎘處理時較對照（0 mg·kg-1鎘處理）差異不顯著（P＞0.05）。隨著鎘脅迫程度增強，龍葵幼苗單株和根系干重在0～40 mg·kg-1處理間差異不顯著，莖、葉和果實干重的變化趨勢不一。與對照相比，果實干重則在20和40 mg·kg-1鎘處理下無明顯變化，高濃度鎘（80和160 mg·kg-1）脅迫顯著降低其生物量。因此，本研究選擇4 0 mg·kg-1鎘濃度進一步試驗。

2.2不同形態氮對鎘脅迫下龍葵生物量的影響

40 mg·kg-1鎘處理下，施加硝態氮的龍葵地上部干重在200 mg·kg-1處理時顯著增加，施氮量為200和400 mg·kg-1時較對照（CK）處理提高60.81% 和61.15%；而地下部干重卻無明顯變化（P＞0.05）。相似地，龍葵地上部干重隨施銨態氮量增加逐漸增加，施加25和50 mg·kg-1時則與CK處理無顯著差異；而施加不同濃度銨態氮對地下部干重無顯著影響。同時，隨施加硝態-銨態氮量增加，地上部干重逐漸增加，而地下部干重在施氮量為50 mg·kg-1時發生轉折。當施400 mg·kg-1銨態氮時，地上部干重較CK提高88.76%，增量顯著高于施用400 mg·kg-1硝態氮（61.15%）與硝態-銨態氮（76.75%）較CK處理的增量（表2）。

表1　鎘處理下龍葵幼苗生長指標及器官干重的變化Table 1 Growth index and dry weight of different parts of S.nigrumplants under Cd treatments

表2　不同形態氮對鎘處理下龍葵幼苗干重的影響Table 2 Effect of different nitrogen forms on dry weight of S.nigrum plants under Cd treatments

2.3不同形態氮對鎘脅迫下龍葵Cd積累的影響

施加不同濃度硝態氮，龍葵地上部鎘累積量（μg·g-1）隨施加濃度升高而顯著增加，當施加量為400 mg·kg-1時較CK處理提高23.15%；地下部鎘累積量在50和100 mg·kg-1施氮量時升高到最大，隨之逐漸降低。與之不同地，地下部鎘累積量在100 mg·kg-1施加硝態-銨態氮時達到最高，隨后與之持平。而施加銨態氮時，地上部和根系鎘累積量隨施加濃度升高而增大，400 mg·kg-1施氮量時鎘累積最高，且較CK處理分別提升56.48%和94.24%（表3）。同時，銨態氮對龍葵地上部和根系鎘的累積能力在施氮量為400 mg·kg-1時顯著高于銨態氮和硝態-銨態氮。另一方面，施加氮肥顯著影響龍葵單株對土壤鎘的累積（μg·plant-1）。隨著不同形態氮施加量增加，單株鎘累積量均表現為不同程度地增加。其中，施加200和400 mg·kg-1銨態氮時單株鎘累積量達最大，較CK處理提升149.84%和152.90%，且在此處理下單株累積量顯著高于硝態氮和硝態-銨態氮處理組（表4）。

2.4不同形態氮對鎘脅迫下龍葵葉綠素的影響

施3種形態氮肥時，Chla、Chlb、Chl含量均隨施加濃度增加而呈不同程度增加，在濃度為400 mg·kg-1時達到最大值（表5）。施加400 mg·kg-1銨態氮時，Chl含量較CK顯著提升86.97%，顯著高于施加銨態氮（75.91%）和硝態-銨態氮（59.41%）引起的增加量；且在400 mg·kg-1施氮量時，Chla、Chlb、Chl含量在施加銨態氮時顯著高于銨態氮和銨態-硝態氮處理。同時，施加硝態-銨態氮下的Chla/b隨施加濃度增加逐漸降低，而施加其他兩種形態氮肥時無明顯變化（P＞0.05）。

2.5不同形態氮對鎘脅迫下抗氧化系統的影響

表3　不同形態氮對鎘處理下龍葵植株組織鎘累積的影響Table 3 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in shoot and root of S.nigrum plants under Cd treatments

表4　不同形態氮對鎘處理下龍葵單株鎘累積的影響Table 4 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in the whole plants under Cd treatments

龍葵葉片活性氧（H2O2）水平隨施銨態氮和銨態-硝態氮量的增加而降低，隨施硝態氮量增加而先降（100和200 mg·kg-1）后升（圖1A）。相似地，MDA含量在施硝態-銨態氮量為50 mg·kg-1時最低，后升高到穩定值（100～400 mg·kg-1）；MDA含量隨其他兩種形態氮施加量增加而逐漸降低（圖1B）。

表5　不同形態氮對鎘脅迫下龍葵葉綠素含量的影響Table 5 Effect of different nitrogen forms on chlorophyll content of S.nigrum under Cd treatments

圖1　不同形態氮對鎘脅迫下龍葵葉片抗氧化系統的影響Fig.1 Effect of different nitrogen forms on antioxidative system of S.nigrum under different Cd treatments

施加硝態氮時，CAT和POD隨著施加濃度增加而減低，SOD活性則先升后降，施加量為25或50 mg·kg-1時達到最高值，200和400 mg·kg-1時無顯著差異（圖1C～E）。隨施加銨態氮濃度增加，SOD活性逐漸降低，POD則逐漸升高；CAT則在施加量為25和50 mg·kg-1時升高后逐漸降低。同時，SOD和CAT隨施加硝態-銨態氮量增加而減低，POD活性則先升高后降低。特別地，施加不同濃度的硝態-銨態氮并沒有改變GSH含量（P＞0.05；圖1F）。

2.6不同形態氮對鎘脅迫下龍葵氮同化的影響

與CK相比，NR和GS活性均隨硝態氮施加量的增加先升后降，在施加量為25～100 mg·kg-1時無顯著差異（P＞0.05）；施加不同濃度銨態氮和硝態-銨態氮時的NR，以及施加硝態-銨態氮時的GS活性隨施加濃度的升高而升高，在100～400 mg·kg-1時無明顯變化；而GS活性在銨態氮施加量為100 mg·kg-1時達到最大，隨后逐漸降低（圖2A～B）。由圖2C可知，GDH活性隨著3種不同形態氮施加量的增加逐漸降低。其中，GDH活性在施加不同濃度硝態-銨態氮肥時顯著低于對照處理，且不同濃度氮處理間無顯著性差異。

圖2　不同形態氮對鎘脅迫下龍葵葉片氮同化酶活性的影響Fig.2 Effect of different nitrogen forms on nitrogen assimilation enzymes of S.nigrum under Cd treatments

3　討論

3.1銨態氮較硝態氮可顯著提高龍葵的抗鎘性

目前，關于Cd毒與氮交互報道多集中于Cd脅迫干擾、破壞正常氮代謝以及抑制植物生長等方面。一般認為，Cd脅迫使硝酸還原酶（NR）活性受抑制，從而干擾植物正常氮素代謝。研究表明，Cd抑制NR主要通過兩條途徑：Cd2+與NR疏基結合；Cd2+誘導ROS生成從而抑制NR（Hemalatha et al.，1997）。施加100～400 mg·kg-1銨態氮顯著提升龍葵葉片NR活性，且維持在相對穩定水平；而施加200 mg·kg-1硝態氮時顯著低于施加25～100 mg·kg-1處理（圖2A），表明施加不同形態氮對Cd毒具不同程度緩解作用，而高濃度（100～400 mg·kg-1）銨態氮作用效果顯著高于硝態氮和銨態-硝態氮。研究顯示，3種形態氮對植株地上和地下部Cd積累量均有提高，而銨態氮的效果優于硝態氮或硝態-銨態氮，特別在施加濃度為400 mg·kg-1時最為顯著。Willaert et al.（1992）研究發現，銨態氮能顯著促進菠菜（Spinacia oleracea）對Cd2+吸收，同時水培下的萵苣（Lactuca sativa）在銨態氮處理下比在硝態氮處理下對Cd的累積能力更強。楊錨等（2006）認為，銨態氮增加Cd的有效性從而增加對Cd的累積，可能是由于土壤中水溶性Cd含量較高。然而，水溶性Cd含量在土壤中的有效態Cd中占有的比例卻很低，植物對Cd的吸收和累積能力有限（Wang et al.，2008）。而地上部作為龍葵累積Cd的主要部位（表3～4），其積累量是衡量龍葵修復效率的關鍵指標。綜上所述，銨態氮對龍葵的強化修復效果優于硝態氮與硝態-銨態氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+為龍葵鎘修復的最佳濃度。

3.2氮素形態影響龍葵抗鎘性可能機理

3.2.1氮素形態影響植物生長和胞外PH值

研究顯示，龍葵地上部干重隨施加硝態氮與銨態氮量增大而增加，地下部干重卻無明顯變化。而施加硝態-銨態氮則顯著提高幼苗地上部和地下部干重（表2）。這些結果表明，3種不同形態的氮肥可能均是以提高植株生物量的策略以適應（鎘）脅迫環境（樓玉蘭等，2005；陳久耿等，2014），而400 mg·kg-1銨態氮處理對生物量的增產效果明顯好于硝態氮或硝態-銨態氮。同時，Chla、Chlb 和Chl含量均隨3種形態氮施量增加而增加（表5）。表明不同形態氮肥能保護葉綠體結構的完整性以及葉綠素合成過程的酶活性（Vitousek et al.，2010），降低葉綠體受到的毒害作用。究其原因，可能是由于氮有助于葉綠素含量的平衡，促進Cd脅迫下類囊體膜蛋白復合體的組裝和穩定，增強水的光解和電子傳遞的速率（張永平等，2014；Liu et al.，2016）。而本研究中Chla/b在施加硝態-銨態氮時差異顯著，施加銨態氮和硝態氮卻無明顯變化，其原因有待進一步研究。

對植物施加單一形態氮素，或由于植物偏好吸收某一形態氮素，由于離子吸收不平衡，會造成生長介質pH值變化。通常情況下，偏好吸收NH4+-N會使介質pH下降，偏好NO3-N會使介質pH上升；且各種金屬離子在酸性條件下生物有效性高，pH值上升則有效性降低（Stratton et al.，2001）。同時，Eriksson（1990）研究表明，銨態氮產生NH4+被施入土壤后，通過硝化作用能在較短時間內使土壤pH值降低。本研究中，施加不同濃度銨態氮會降低胞外pH，提高Cd2+生物有效性，促進超累積植物龍葵對Cd離子的吸收和轉運，這也與施銨態氮時其地上部Cd2+累積量顯著高于硝態氮具有一致性（表4）。同時，在強酸性環境下，龍葵可能強化了質膜H+-ATPase活性，把胞質內多余H+泵出胞外，在細胞膜微小區域內形成更高電勢區，從而減少金屬陽離子進入細胞（Takei et al.，2002）。同時，鎘離子進入植株細胞會抑制NR活性（數據未顯示），NH4+在體內還原利用會產生大量H+，降低胞質pH，在一定程度上提升Cd有效性，這可能與酸性條件會激發電負性基團富集，加強與Cd2+結合使其沉淀在胞外而解除Cd毒害（Li et al.，2014）。

3.2.2氮素形態影響抗氧化系統

保護酶系統在活性氧清除、抑制膜脂過氧化等植物抗逆生理方面發揮作用。本研究中，施加不同形態氮肥較對照（CK）顯著降低龍葵葉片活性氧（H2O2與MDA，圖1），表明3種形態氮顯著緩解Cd毒害。同時，施加不同濃度硝態氮降低葉片CAT 和POD活性，而SOD活性在施氮量50～100 mg·kg-1時上升，隨后逐漸降低。施加較低濃度硝態氮作用下，SOD在催化活性氧過程中起主導作用（Liu et al.，2015），這可能是因為氮（NO3-）作為抗性基因的信號分子，增強SOD編碼基因mRNA表達量（Pankovic et al.，2000），誘導同工酶Zn-SOD表達的結果。當植物根系受外界硝態氮誘導時，根系對NO3-的吸收能力迅速增加，NO3-可明顯誘導TaNRT 2.1和TaNRT 2.3表達（Vidmar et al.，2000），增加氮吸收與其ROS代謝具有相關性。隨施加銨態氮濃度的增加，CAT活性先升后降，POD活性逐漸增強，而SOD活性則逐漸降低。表明施加較低濃度銨態氮時，POD與CAT在催化活性氧的過程中起著主導作用；而在較高濃度下則由POD單獨作用ROS清除。相似地，POD在較低濃度硝態-銨態氮施加時起主導作用。這可能是由于氮對含鐵酶類（CAT、APX等）有很高的親和性，能誘導同工酶CAT1和CAT2的表達或調節CAT與細胞色素C氧化酶（COX）等含血紅素鐵酶類活性（張永平等，2014）。同時，通過GSH含量的升高激活抗壞血酸-谷胱甘肽（AA-GSH）循環有效運轉，然后通過鳥甘酸環化酶（GC）介導催化三磷酸鳥苷（GTP）轉化為鳥嘌呤核糖苷-3'（cGMP）實現（Xu et al.，2010）。因此，施加較低或較高濃度銨態氮較硝態氮和硝態-銨態氮，顯示出較高效率提升抗氧化酶（POD）活性從而緩解Cd毒害效應。

3.3.3氮素形態影響葉片氮同化

研究表明，植物吸收硝態氮是通過根細胞的質膜載體，即高親和力轉運系統（HATS-PTR）和低親和力轉運系統（LATS-NNP），以相偶聯的跨膜質子梯度能量驅動，Cd脅迫顯著地降低質膜P型ATPase活性。植物對氮素的吸收主要是以NO3--N的形式進入植物體內，即使用銨態氮或硝態-銨態氮都需要在土壤中經硝化作用轉變為NO3--N后被植物吸收利用（Carolina et al.，2010）。NR是植物同化硝態氮過程中的關鍵酶和限速酶。Hernandez et al.（1996）研究表明，一定濃度的Cd能夠抑制葉片的NR活性，降低根系對N的吸收和轉運。本研究表明，40 mg·kg-1Cd脅迫顯著降低植株NR（圖2），NR活性的降低可能與植物中硝酸鹽含量減少相關。另一方面，植物根系吸收的NO3--N必須在NR作用還原成NH4+-N（Gibson，2005），經過GS-GOGTA循環在體內轉化成氨基酸，才能完成氨初級同化。而GS作為氮代謝中心的多功能酶，活性提高對其代謝效率起著關鍵性作用。Chien et al.（2000）對水稻（Oryza glaberrima）的研究表明，Cd脅迫顯著降低GS活性，從而降低水稻葉片和根系對NH4+-N的累積，本試驗結果也證實了該觀點。GDH廣泛存在于植物組織中，Cd脅迫下可補充谷氨酸庫，為Cd-PCs合成提供原料。同時，GDH可實現對高濃度NH3循環解毒（NH3來自于GS活性降低及有機N降解）（Gouia et al.，2000）。本試驗中，植株GDH活性在鎘脅迫下顯著升高，表明在Cd脅迫下植物NH3同化過程可能起著重要作用（Chugh et al.，1992）。而施加不同形態氮肥則在不同程度上緩解了Cd對植物的脅迫作用，可能由于其能夠顯著提高還原動力泵硝酸還原酶的活性，減少了硝酸鹽的累積（陳久耿等，2014）。研究發現，隨硝態氮施加濃度增大，NR與GS活性呈先升后降趨勢。隨施加銨態氮濃度增大，NR活性逐漸升高至穩定，GS活性先升后降，GDH活性則逐漸降低至穩定。而隨著添加硝態-銨態氮濃度增大，NR和GS活性逐漸升高至穩定，緩解因Cd脅迫引起GOGAT活性所受到的抑制作用（趙新月等，2013）；而GDH在25～400 mg·kg-1處理間差異不顯著（圖2C）。Cd和不同形態氮引起的氮代謝變化非常復雜，可能由于水分匱乏或可利用氮和碳的改變，也可能是由于關鍵酶活性變化，具體原因還有待進一步研究。

4　結論

綜上所述，3種形態氮素在一定程度上均能緩解Cd脅迫對龍葵幼苗的毒害效應。然而，相對于施加硝態氮和硝態-銨態氮，銨態氮可顯著提高龍葵幼苗的抗鎘性，且在400 mg·kg-1的NH4+時效果最佳。同時，NH4+-N提高抗鎘性可能與植物葉綠素、胞外PH值、抗氧化系統及氮同化相關。因此，施加適宜濃度銨態氮能提升龍葵中的鎘含量和積累量，是修復鎘污染土壤的一項簡單易行的農藝措施。

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Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi*
College of Landscape Architecture，Sichuan AgriculturalUniversity，Chengdu 611130，China

Abstract：Solanum nigrum L.has been discovered to be a Cd hyperaccumulating species，and is therefore used for phytomining and phytoextracting Cd from contaminated soils.The effects of different nitrogen forms ［（NH4）2SO4，NaNO3，NH4NO3］ on plant growth，Cd accumulation，antioxidant system and nitrogen assimilation were investigated in the hyperaccumulator plant Solanum Nigrum L.The results showed that:（1） Cd treatments （10～160 mg·kg-1） significantly impacted biomass and diameter of root and shoot，and decreased the accumulation.However，the addition of three doses of nitrogen forms significantly alleviate the toxic effects of 40 mg·kg-1cadmium，which mainly due to the promotion of shoot biomass，Cd accumulation and chlorophyll contents.Moreover，（NH4）2SO4（400 mg·kg-1） is more effective in the accumulation of biomass than others.（2） The content of leaf hydrogen peroxide （H2O2） was decreased with increasing （NH4）2SO4and NH4NO3doses，while its level was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.（3） Similarly，activities of catalase （CAT） and peroxidase （POD） were decreased with increasing NaNO3and NH4NO3doses，while activity of superoxide dismutase （SOD） was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.Interestingly，with increasing （NH4）2SO4doses，POD activity was increased significantly，suggesting that （NH4）2SO4can markedly improve its antioxidant capacity.（4） The activities of nitrate reductase （NR） and glutamine synthetase （GS） were ascended first and then declined with increasing NaNO3doses，while the GS activity was the maximum value at concentration of 100 mg·kg-1（NH4）2SO4，and then gradually decreased.In addition，activity of glutamate dehydrogenase （GDH） was decreased with the increasing of nitrogen doses of three forms.Besides，the content of GSH did not showed significant differences among different NH4NO3doses.These indicate that the enhancing effect of （NH4）2SO4on Cd extraction is more obvious than that of NaNO3and NH4NO3.That is to say，（NH4）2SO4should be the better choice on the soil Cd phytoremediation of S.nigrum，thus it could be applied to strengthen S.nigrum L.phytoremediation of Cd-contaminated soils.

Key words：Solanum nigrum L.； nitrogen forms； cadmium stress； nitrogen assimilation； antioxidant system

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.024

中圖分類號：X171.5

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）04-0715-09

基金項目：四川農業大學學科建設雙支計劃項目（03571458）

作者簡介：楊容孑（1989年生），女，博士研究生，主要從事生態恢復與生態穩定性研究。E-mail:arong.jie@163.com楊容孑與劉柿良為共同第一作者

*通信作者。E-mail:scpyzls@163.com

收稿日期：2016-01-20