Fas及FasL在滋養細胞、葡萄胎及絨癌中的表達

肖發菊　黃愛華

[摘 要] 目的：探討Fas及FasL在滋養細胞、正常葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨癌中的表達及意義。方法：利用免疫組織化學方法檢測Fas及FasL蛋白在正常滋養細胞（40例）、完全性葡萄胎（36例）、侵襲性葡萄胎（20例）、絨癌（20例）中的表達；用逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測 Fas、FasL基因在4組組織中的表達。結果：免疫組織化學方法顯示Fas蛋白在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組的陽性表達率分別為90%（36例）、86.1%（31例）、40%（8例）、30%（6例），FasL蛋白在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組的陽性表達率分別為17.5%（7例），27.8%（10例）、55%（11例）、75%（15例）。在侵蝕性葡萄胎和絨癌中Fas蛋白低表達、FasL蛋白高表達；PCR結果顯示 Fas基因在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌組中表達量逐漸降低，而FasL基因表達量逐漸升高。結論：在侵蝕性葡萄胎及絨癌中Fas低表達及FasL高表達，這與侵蝕性葡萄胎及絨癌的凋亡機制密切相關。

[關鍵詞] 侵襲性葡萄胎；絨癌；Fas；FasL

中圖分類號：R737.3 文獻標識碼：B 文章編號：2095-5200（2016）03-097-03

DOI：10.11876/mimt201603036

侵襲性葡萄胎與絨毛膜上皮癌（簡稱絨癌）是妊娠滋養細胞疾病中常見惡性腫瘤[1-3]。滋養細胞來源于胚胎外胚層[4]，當其異常增生，間質水腫，終末絨毛發生轉變，形成大小不一水泡，形成葡萄胎。葡萄胎組織侵入子宮肌層或者轉移到宮外時，具有惡性潛能即為侵襲性葡萄胎[5]。絨癌也多繼發于葡萄胎[6-8]，其惡性程度更高，更易發生全身轉移，導致患者死亡。

1989年Yonehara等 [9]發現一種因子可以識別表達于髓樣細胞、T淋巴細胞和成纖維細胞表面的未知分子，誘導多種人細胞系發生凋亡，于是將這種因子命名為Fas。隨后進一步研究發現Fas、FasL是重要細胞凋亡調控因子，并在多種腫瘤存在異常表達[10-12]。本實驗研究Fas、FasL在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達情況，以RT-PCR檢測Fas、FasL基因在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達情況，為揭示侵蝕性葡萄胎組和絨癌凋亡機制提供資料。

1 材料和方法

1.1 材料

Fas、FasL抗體（福州邁新生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit試劑盒（廈門艾德生物醫藥科技有限公司）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit （北京康為世紀生物科技有限公司）；Golden view（莊盟國際生物基因科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本來源 收集本院2013年 3月至 2015年 9月期間臨床資料完整、病理檢查診斷明確的116例樣本（正常滋養細胞40例、完全性葡萄胎36例、侵襲性葡萄胎20例、絨癌20例）。在上述4組石蠟標本中每種隨機選取5例，對每組5例石蠟標本分別提取總RNA，反轉成cDNA，用RT-PCR檢測Fas、FasL基因在組織中表達。

1.2.2 免疫組織化學實驗方法

1）脫蠟和水化。2）抗原修復。3）免疫組織化學染色： 3%H2O2滴加在組織上，室溫靜置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；滴加Ⅰ抗50μL， 4℃過夜；PBS洗3次各5min；滴加Ⅱ抗50μL，37℃20min；PBS洗3次各5min；DAB顯色2～3min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗5min；蘇木精復染3min，鹽酸酒精分化3秒；自來水沖洗10min；脫水、透明、封片、鏡檢。4）結果判讀：Fas及FasL 蛋白以胞漿、包膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，具體判斷標準是按照染色強度和顯色細胞占總細胞百分比結合進行評分：陽性強度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記為0、1、2、3分，顯色細胞占總細胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、>50%分別記為0、1、2、3分，兩項積分相乘，>3分記為陽性。

1.2.3 石蠟組織總RNA提取 使用RNeasy FFPT試劑盒，按照說明書提取各組標本總RNA。經反轉體系得到cDNA，用RT-PCR方法檢測Fas、FasL基因表達。RT-PCR對Fas、FasL基因引物進行擴增，條件如下：98℃ 10s，56/57℃ 30s，72℃ 30s，40個循環。RT-PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像儀顯示，以ActinPCR擴增作為內參。

1.2.4 統計學處理 使用SPSS11.0軟件系統，計數資料進行χ2檢驗或Fishers確切概率法檢驗，相關比較采用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測Fas、FasL蛋白表達情況

從表1來看，Fas蛋白在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組陽性表達率下降，FasL蛋白在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌陽性表達率依次升高。

2.2 Fas、FasL 基因表達

從圖1結果來看，Fas基因在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌中表達量逐漸降低，FasL基因正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組、絨癌中表達量逐漸升高。

3 討論

侵襲性葡萄胎與絨癌[13-14]均起源于葡萄胎。以陰道不規則出血、子宮復舊不全或不均勻增大，偶有腹痛，易發生宮外轉移為主要特點?；瘜W療法是侵襲性葡萄胎與絨癌主要治療手段[15]，通過聯合用藥抑制癌細胞增殖。但是在治療過程中，患者經常出現耐藥現象，這種現象與Fas、FasL因子密切相關。

Fas屬于壞死因子/神經生長因子分子受體超家族成員[16]，在細胞凋亡及體內免疫調節方面發揮重要作用。FasL屬于Ⅱ型跨膜蛋白和腫瘤壞死因子家族成員[17]，能與Fas特異性結合，誘導細胞發生程序性凋亡。但是在惡性腫瘤細胞中Fas低表達或者不表達，避開殺傷性T 細胞表面FasL介導的細胞凋亡，使癌細胞在體內存活下來。在惡性腫瘤細胞表面FasL表達增加，與激活T 淋巴細胞表面 Fas 結合，誘導T細胞凋亡，從而破壞機體免疫系統。

本實驗發現Fas蛋白在正常滋養細胞組、完全性葡萄胎組、侵蝕性葡萄胎組和絨癌組陽性表達率逐漸下降，Fas蛋白在正常組表達量明顯高于侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達量，FasL蛋白在正常組表達量明顯低于侵蝕性葡萄胎組和絨癌組表達量，差異有統計學意義。PCR結果亦顯示 Fas基因、FasL基因表達與免疫組化結果相符。說明Fas、FasL與細胞凋亡密切相關。

Fas、FasL 在侵蝕性葡萄胎和絨癌發生和發展中發揮重要作用，研究表明Fas、FasL參與化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡過程，表現出與多種腫瘤的耐藥性相關，下一步可針對Fas、FasL基因藥物靶向進行深入研究。

參 考 文 獻

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