五倍子蜂蜜TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立

孫 濤，夏明星，孔德英，張學健，滕少娜，鄧朝暉，夏曉華，李應國＊

（1.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020；2.國家中藥材物種鑒定及質(zhì)量安全檢測重點實驗室，重慶400020；3.萬州出入境檢驗檢疫局，重慶404100；4.重慶峰谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司，重慶404100）

五倍子蜂蜜TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的建立

孫 濤1，2，夏明星3，孔德英1，2，張學健4，滕少娜1，2，鄧朝暉1，2，夏曉華4，李應國3＊

（1.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020；2.國家中藥材物種鑒定及質(zhì)量安全檢測重點實驗室，重慶400020；3.萬州出入境檢驗檢疫局，重慶404100；4.重慶峰谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司，重慶404100）

為五倍子蜂蜜的鑒定檢測提供技術支撐，利用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術，以五倍子樹基因組中ITS基因為靶序列，設計并篩選出特異性引物探針，通過特異性、靈敏度和重復性等試驗，建立五倍子蜂蜜TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法。結果表明：建立的方法特異性良好，生成的標準曲線有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）為0.998，最低檢測限為0.2pg DNA／反應。該方法特異性強、靈敏度高、結果可靠。

五倍子樹；蜂蜜；檢測；TaqMan實時熒光定量PCR

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)［1］。蜂蜜含有豐富的必需氨基酸、維生素、多酚類、類黃酮類、多糖、活性酶和類胡蘿卜素等活性物質(zhì)，具有多種生理功能，如抗氧化、抗菌、加速創(chuàng)傷修復和增強免疫等［2－3］。根據(jù)國際食品法典委員會蜂蜜標準、歐盟蜂蜜指令及其他相關規(guī)定，蜂蜜種類可按照來源、生產(chǎn)方式或外觀劃分［4－5］。一般是按照蜜蜂所采集的蜜源植物劃分，主要蜜源是單一植物的稱作單花種蜂蜜，采自多種植物的為雜花蜜或百花蜜。不同蜜源植物來源的蜂蜜成分主要取決于植物類型、花期、氣候、蜂群強弱以及取蜜時間等，不僅在感官和內(nèi)在品質(zhì)上有一定差異，其營養(yǎng)效果也不同。傳統(tǒng)方法難以辨別蜂蜜種類，容易造成蜂蜜市場價格混亂，且品種標識混淆［6］。因此，有必要開展蜂蜜種類鑒定研究。

五倍子蜂蜜是蜜蜂采自五倍子樹的花粉釀制而成，為中藥材蜜種，也是難得的森林蜜種，具有解毒、殺菌和止腹瀉等作用，對肺腎雙虛、脾腎虛寒、氣促喘乏、痰火郁肺有良好輔療效果，特別適合虛汗、肺虛、腎虛、久瀉久痢、痔血和便血等人的日常食療保健之用，市場需求量較大。五倍子蜂蜜市場售價是普通蜂蜜價格的3～5倍，市場上常出現(xiàn)廉價蜂蜜假冒五倍子蜂蜜的現(xiàn)象，極大地損害了消費者的利益，因此亟待建立切實可靠的五倍子蜂蜜鑒別技術。

近年來，實時熒光定量PCR技術以其靈敏度高、速度快、特異性強的優(yōu)點在基因表達水平分析、多態(tài)性研究、物種特異性檢測等方面得到廣泛應用［710］。TaqMan探針法［11－14］作為高度特異的實時熒光定量PCR技術，其核心是利用Taq酶的3′～5′外切核酸酶活性，切斷位于2條引物之間僅與模板特異性結合的探針，產(chǎn)生熒光信號，儀器通過收集分析信號進行結果判定，其結果準確、分辨率更高。鑒于此，筆者利用TaqMan熒光探針技術，建立一種特異性檢測五倍子蜂蜜蜜源成分的實時熒光PCR方法，旨在為五倍子蜂蜜的檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 蜂蜜與蜜源

成熟五倍子蜂蜜，由重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司提供。蜜源植物為五倍子樹、紅麩楊、青麩楊和白背麩楊，由重慶市藥用植物研究所提供。油菜蜜、棗花蜜、荊條蜜、益母草蜜、柑橘蜜和荔枝蜜，由重慶蜂谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司提供。

1.2 引物與探針

從美國國立生物技術信息中心（NCBI）網(wǎng)站基因庫（GenBank）下載鹽膚木屬所有物種的ITS基因序列，并進行同源性分析，用Primer Premier 5.0軟件分析設計引物和探針，篩選得到針對五倍子樹的特異性引物探針。正向引物RCF：5′－AAACCTG CCTAGCAGAACGA－3′，反向引物RCR：5′－TAA GATTTCCTTGGCGCAAT－3′，探針RCPRO：5′－ACACGTGYTGCGCTGGGCGTCGGTCGTA－3′，探針兩端分別用FAM和TAMRA標記，引物和探針由上海生工生物合成及標記。

1.3 蜂蜜及蜜源植物樣本DNA的提取

蜂蜜DNA提取：稱取蜂蜜樣品10g放入有磁力攪拌子的50mL小燒杯中，加滅菌雙蒸水20mL，40℃恒溫振蕩20min，使蜂蜜樣品和水充分混合均勻，轉(zhuǎn)移至50mL離心管；12 000r／min離心10min，迅速倒掉上清液，保留沉淀；用去離子水2mL沖洗離心管管壁上的沉淀，轉(zhuǎn)入2mL離心管中，12 000r／min離心10min，棄上清液，保留沉淀［15］。然后用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

蜜源植物樣本DNA提取：五倍子樹、青麩楊、紅麩楊的葉片DNA用磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒提取。

1.4 五倍子蜂蜜TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測體系的建立

1.4.1 PCR反應 采用經(jīng)過優(yōu)化后的最佳反應體系和條件。總反應體系20μL：2×定量熒光PCR反應預混液（TaqMan Mix）10μL、上下游引物（10μmol／L）各0.4μL、TaqMan探針（10μmol／L）0.8μL、DNA 4μL、滅菌去離子水4.4μL。熒光定量PCR反應條件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40個循環(huán)。試驗過程中觀察PCR熒光擴增曲線，根據(jù)循環(huán)數(shù)（Ct）值進行結果判定。

1.4.2 特異性檢測 以五倍子樹近緣種及常見蜂蜜蜜源植物的DNA作為模板，包括五倍子樹、白背麩楊、紅麩楊、青麩楊、油菜、棗、荊條和益母草，以五倍子樹的DNA為陽性對照，滅菌去離子水為空白對照，按照PCR反應的體系及條件進行實時熒光PCR反應，分析該方法的特異性。

1.4.3 靈敏度檢測 用滅菌去離子水將提取的五倍子樹基因組DNA（濃度為5×103pg／μL）10倍梯度稀釋成7個濃度，分別為5×103～5×10－3pg／μL，取4μL作為模板按照PCR反應的方法進行靈敏度檢測。

1.4.4 重復性試驗 分別取上述稀釋后的五倍子樹基因組DNA作為模板，進行熒光定量PCR反應。在同一個試驗中，每個濃度DNA做3次重復，以分析組內(nèi)差異。再以相同DNA為模板，在不同時間段進行3次獨立重復試驗，以分析組間差異。通過計算變異系數(shù)驗證該方法的穩(wěn)定性。

1.4.5 標準曲線的建立 分別取上述稀釋后的五倍子樹基因組DNA作為模板，每個濃度重復3次試驗，同時以滅菌去離子水為陰性對照。按照PCR反應的方法進行實時熒光PCR反應。經(jīng)Stepone plus熒光定量PCR儀軟件自動分析得到熒光定量PCR方法的標準曲線。

1.4.6 蜂蜜樣本實測 為評價建立方法對蜂蜜樣本檢測的實用性，分別以五倍子蜂蜜、油菜蜜、棗花蜜、荊條蜜、益母草蜜、荔枝蜜和柑橘蜜的DNA為模板，按照PCR反應的方法進行實時熒光定量PCR反應。

2 結果與分析

2.1 特異性及靈敏度

從圖1可知，TaqMan探針實時熒光定量PCR方法檢測五倍子樹、五倍子蜂蜜呈典型的陽性反應，Ct值分別為22.49、22.40和31.87、31.02，呈特異性S形熒光擴增曲線；檢測白背麩楊、紅麩楊、青麩楊、油菜、棗、荊條和益母草均為典型的陰性反應，未見特異性熒光擴增曲線，均無熒光值增長。表明，所建立的五倍子TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法具有較強的特異性。

TaqMan探針實時熒光定量PCR方法具有較佳的線性檢測范圍，當DNA濃度為0.05pg／μL時，仍能夠獲得強的熒光信號，產(chǎn)生良好的特異性熒光擴增曲線，故最低檢測限是0.2pg DNA／反應。說明，該檢測方法具有較高的靈敏度。

圖1 TaqMan探針實時熒光定量PCR方法的特異性（左）及靈敏度（右）圖譜Fig.1 Specificity（left）and Sensitivity（right）graph of the TaqMan real－time PCR assay

2.2 重復性

從表中看出，組內(nèi)重復Ct值變異系數(shù)為0.33%～1.46%，組間變異系數(shù)為0.48%～ 3.53%，均在合理范圍。表明，建立的五倍子蜂蜜TaqMan探針實時熒光定量PCR檢測方法的穩(wěn)定性良好。

表TaqMan探針實時熒光定量PCR方法檢測五倍子樹的重復性結果Table Repetitive experimental results of the TaqMan real－time PCR assay for detecting nutgall tree

圖2 TaqMan探針實時熒光定量PCR方法檢測五倍子樹的標準曲線Fig.2 Standard curve map of the TaqMan real－time PCR assay for detecting nutgall tree

2.3 標準曲線

從圖2看出，標準曲線中Ct值和DNA濃度間呈良好的線性關系，實時熒光定量PCR檢測五倍子DNA的線性范圍是103～10－2，標準曲線的相關系數(shù)（R2）為0.998（y＝－3.747x＋29.482），擴增效率為84.876%。表明，建立的實時熒光定量PCR檢測方法有6個數(shù)量級的線性檢測范圍，進一步說明該檢測方法具有很高的靈敏度。

2.4 樣品實測結果

對重慶峰谷美地生態(tài)養(yǎng)蜂有限公司五倍子蜂蜜生產(chǎn)基地的30份五倍子蜂蜜樣品及市購的五倍子蜜、油菜蜜等進行實時熒光定量PCR檢測。結果表明，所有五倍子蜂蜜檢測結果均為陽性，油菜蜜、棗花蜜、荊條蜜、益母草蜜、荔枝蜜和柑橘蜜檢測結果均為陰性（圖3）。說明檢測方法的準確度高。

圖3 TaqMan探針實時熒光定量PCR方法對樣品的實測結果Fig.3 Samples measured drawing of the TaqMan realtime PCR assay for sample detection

3 結論與討論

目前，國內(nèi)外對蜂蜜真?zhèn)蔚蔫b別主要集中在淀粉類、糖類、代糖類等添加物上，即通過離子色譜法、穩(wěn)定碳同位素比率法、液相色譜示差折光法等檢測蜂蜜中碳－4－植物糖、淀粉糖等的含量，并已形成多種國家標準方法［16－17］。但是，對于蜜源成分的檢測及研究較少。對蜂蜜蜜源成分的檢測常用方法為蜂蜜中植物花粉含量的測定［18］，即通過顯微鏡觀察蜂蜜中蜜源植物的花粉并計數(shù)，計算蜜源植物花粉數(shù)占總花粉數(shù)的比率來確定花粉含量及濃度。這種方法對生物分類學要求較高，必須先認識蜜源植物花粉，且費時費力，而且五倍子蜂蜜中植物花粉的含量及濃度并未收入GB／T 23194－2008蜂蜜中植物花粉的測定方法［18］標準中，不適用于五倍子蜂蜜的檢測。

本研究通過分子生物學方法，利用TaqMan探針實時熒光定量PCR技術，選取五倍子樹基因組中ITS序列較為保守的區(qū)域，設計針對五倍子樹的特異性TaqMan引物探針，建立了五倍子樹TaqMa探針實時熒光定量PCR檢測方法，并成功應用于五倍子蜂蜜的快速檢測。該方法對植物分類學要求不高，有分子生物學基礎的人員均可進行檢測操作，方法簡便，特異性良好，生成的標準曲線有良好的線性關系，相關系數(shù)（R2）為0.998；靈敏度高，最低檢測限為0.2pg DNA／反應。本方法解決了樣品是否含有五倍子蜂蜜的問題，而對于是否是其純蜂蜜需進一步研究。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB14963－2011食品安全國家標準蜂蜜［S］.北京：中國標準出版社，2011.

［2］史伯倫.蜂產(chǎn)品與人類健康［J］.蜜蜂雜志，2005（8）：11－13.

［3］王橋林，蜂王漿蜂蜜治燒傷療效好［J］.蜜蜂雜志，2000（6）：20.

［4］Codex standard12－2001.Codex Standard for Honey ［S／OL］.［2015－10－20］.http：／／www.docin.com／p－468227644.html.

［5］Council Directive（EC）2001／110ff［S］.J Europ Communities，2002，10：47－52.

［6］陳蘭珍，葉志華，趙 靜.蜂蜜品種鑒別技術研究進展［J］.食品科學，2008，29（3）：494－498.

［7］馬月萍，戴思蘭，馬艷蓉.熒光定量PCR技術在植物研究中的應用［J］.生物技術通報，2011（7）：37－44.

［8］陳 旭，齊鳳坤，康立功，等.實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，41（8）：148－155.

［9］歐陽松應，楊 冬，歐陽紅生，等.實時熒光定量PCR技術及其應用［J］.生命的化學，2004，24（1）：74－75.

［10］張 蓓.實時熒光定量PCR的研究進展及其應用［J］.國外醫(yī)學：臨床生物化學與檢驗學分冊，2003，24（6）：327－329.

［11］鄧文星，張 映.實時熒光定量PCR技術綜述［J］.生物技術通報，2007（5）：93－95.

［12］王忠發(fā)，邵俊斌，沃健兒，等.Taqman實時熒光定量PCR快速檢測白斑綜合癥病毒的方法研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（6）：663－665.

［13］高正琴，邢 進，馮育芳，等.TaqManMGB探針實時熒光定量PCR快速檢測布魯氏菌［J］.中國人獸共患病學報，2011，27（11）：995－1000.

［14］周 勇，曾令兵，孟 彥，等.大鯢虹彩病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.水產(chǎn)學報，2012，36（5）：772－778.

［15］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN／T2135－2008蜂蜜中轉(zhuǎn)基因成分檢測方法普通PCR方法和實時熒光PCR方法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［16］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB／T21533－2008蜂蜜中淀粉糖漿的測定離子色譜法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［17］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB／T18932.1－2002蜂蜜中碳－4植物糖含量測定方法穩(wěn)定碳同位素比率法［S］.北京：中國標準出版社，2002.

［18］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB／T23194－2008蜂蜜中植物花粉的測定方法［S］.北京：中國標準出版社，2008.

（責任編輯：馮 衛(wèi)）

Establishment of a TaqMan real－time PCR Assay for Detecting the Chinese Gall Honey

SUN Tao1，2，XIA Mingxing3，KONG Deying1，2，ZHANG Xuejian4，TENG Shaona1，2，DENG Zhaohui1，2，XIA Xiaohua4，LI Yingguo3＊

（1.Chongqing Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau of China，Chongqing400020；2.State Key Laboratory of Chinese Herbal Medicine Species Identification and Quality Safety Testing，Chongqing 400020；3.Wanzhou Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau of China，Chongqing 404100；4.Chongqing FOGO Ecological Apiarian Co.，LTD，Chongqing404100，China）

In order to provide technical support for identification test of the Chinese gall honey，the TaqMan real－time PCR technique was used to develop a assay for detecting the Chinese gall honey.Primers and probe were designed from the ITS gene of Nutgall Tree and its specificity，sensitivity and repeatability were test in the paper.Results：The TaqMan real－time PCR assay for detecting the Chinese gall honey has good specificity，high detection sensitivity and reliable results.The detection limit was 0.2pg DNA／reaction.A good linear correlation was demonstrated in the standard curve for the real－time PCR assay，the correlation coefficient was 0.998.

nutgall tree；honey；detection；TaqMan real－time PCR

Q754

A

1001－3601（2016）08－0329－0015－04

2015－12－15；2016－06－13修回

重慶市科技計劃項目“秦巴山區(qū)特色蜂蜜（五倍子）基因真?zhèn)舞b別技術研究”（cstc2014yykfA80022）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目“基于DNA條形碼的三種重要炭疽菌快速檢測技術研究”（2015IK336）

孫 濤（1985－），男，農(nóng)藝師，從事植物檢疫研究。E－mail：hisun1985＠126.com

＊通訊作者：李應國（1965－），男，研究員，從事動植物檢疫研究。E－mail：ciqlyg＠163.com