豬肉組織及尿液中萊克多巴胺的快速檢測

黨 娟，李 平，牛治存，王大敏，何國書，2，馮才偉

（1.貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州貴陽550009；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京100012）

畜牧·獸醫·水產

豬肉組織及尿液中萊克多巴胺的快速檢測

黨 娟1，李 平1，牛治存1，王大敏1，何國書1，2，馮才偉1

（1.貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州貴陽550009；2.北京勤邦生物技術有限公司，北京100012）

為實現豬肉組織中萊克多巴胺殘留大量樣本的快速檢測，選用萊克多巴胺酶聯免疫吸附（ELISA）、化學發光微粒子免疫（CMIA）檢測試劑盒對豬肉、豬肝和尿液3種樣品中萊克多巴胺殘留量進行檢測，并與國家標準檢測氣相色譜－質譜法（GC－MS）進行比較。結果表明：ELISA、CMIA這2種試劑盒對豬肉、豬肝、尿液樣品在萊克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2個水平的平均回收率達90.4%～103.4%，變異系數均小于10%；對豬肉、豬肝和尿液3種樣品的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；2種試劑盒與GC－MS檢測實際樣品的判斷結果一致，且檢測時間短，僅需少量儀器，檢測準確度高，適合大批量樣品檢測。

萊克多巴胺；酶聯免疫吸附法；化學發光微粒子免疫法；氣相色譜－質譜法

β－興奮劑是營養重分配劑的一種，是一類結構及功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，萊克多巴胺（Ractopamine，RAC）屬于β－興奮劑，可以加快畜禽生長速度，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率［1－3］。β2－腎上腺素受體激動劑的結構、作用與腎上腺素和去甲腎上腺素相似，由芳香環、β－羚基和脂肪氨基3個活性基團組成。這些基團形成的特異性結構構成了與β－AR的結合位點。這些藥物的作用機理是與組織細胞如血管平滑肌、細支氣管平滑肌的β2受體結合，激活細胞膜上的腺昔酸環化酶，引起細胞產生一系列變化，導致氣管、支氣管平滑肌松弛，骨骼肌收縮，血管平滑肌松弛，過敏介質釋放減少，并增加呼吸道纖毛運動，促進痰液排出，最初用來治療呼吸系統疾病［4－8］。但過量使用萊克多巴胺會殘留在畜禽肌肉組織中，對人體健康產生毒副作用，如心跳加快和呼吸困難等癥狀［9－10］；對鼠的毒性屬于低毒級［11］。

在歐盟，β－興奮劑已被禁止作為家禽的生長促進劑［12］，我國也禁止在飼料和飲用水中使用，如：萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西嗎特羅和硫酸特布他林等［13］。但由于萊克多巴胺屬于非處方藥，且價格遠低于克侖特羅，因此其非法應用者不斷增多。目前，應用于β－興奮劑的檢測方法主要是經典的色譜法和免疫分析法。為檢驗北京勤邦生物技術有限公司生產的酶聯免疫（ELISA）試劑盒、化學發光微粒子免疫（CMIA）試劑盒的檢測效果，分別采用ELISA和CMIA 2種方法對豬肉組織、尿液中萊克多巴胺進行檢測，并與氣相色譜－質譜（GC－MS）法比較，以期實現豬肉組織中萊克多巴胺殘留大量樣本的快速檢測以及該試劑盒的推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：豬肉、豬肝臟和豬尿液，采自貴陽某屠宰場。

試劑：萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒，萊克多巴胺CMIA檢測試劑盒（北京勤邦生物技術有限公司），萊克多巴胺標準品（美國Sigma公司），甲醇（色譜純，天津市富宇精細化工有限公司），丙酮、異丙醇、甲苯、乙酸乙酯、濃硫酸、濃鹽酸、高氯酸和濃氨水等（均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司）。

1.2 儀器

磁免疫全自動化學發光檢測儀（北京勤邦生物技術有限公司），酶標分析儀（Multiskan MK3，美國Thermo公司），高速電動勻漿機（FSH－Ⅱ型，江蘇中大儀器廠），恒溫振蕩器（CHZ－82A，上海百典儀器設備有限公司），高速離心機（GT16－3A，北京時代北利離心機有限公司），渦旋儀（QL－901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司），天平（ESJ200－4，沈陽龍騰電子有限公司），微量移液器（單道20～200μL、100～1 000μL，多道250μL，美國Thermo公司），GC－MS氣質聯用儀〔ISQ，賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕。

1.3 樣品前處理

1.3.1 ELISA樣品

1）尿液。取20μL清亮尿樣直接測定（如尿樣渾濁必須通過過濾，或在20～25℃、3 000r／min以上離心10min，直至清亮）。

2）豬肉／豬肝。用均質器均質豬肉或肝臟樣本，稱取（2.0±0.05）g均質物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入2%NaCl－0.2mol／L HCl－甲醇混合液4mL，3 000r／min以上振蕩30s，取0.5mL上清液，加入0.5mol／L氫氧化鈉溶液30mL，再加入復溶液0.5mL，20～25℃、3 000r／min離心10min；取20μL上層溶液用于分析。

1.3.2 CMIA樣品

1）尿液。其處理方法同ELISA樣品尿液前處理。

2）豬肉。用均質器均質豬肉樣本，稱取（2.0± 0.05）g均質物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入提取工作液（試劑1：量取濃鹽酸4.15mL，加入去離子水定容至500mL；試劑2：稱取十二水合磷酸氫二鈉0.44g、二水合磷酸二氫鈉1.37g，加入500mL去離子水溶解混勻；試劑3：量取4mL試劑1、40mL試劑2和16mL甲醇混勻），然后再加入6mL試劑3，用渦旋儀渦動2min，然后20～25℃、3 000r／min以上離心5min；取500μL上清液加入750μL復溶工作液，用渦旋儀渦動20s，用于分析。

3）豬肝。用均質器均質肝臟樣本，稱取（2.0± 0.05）g均質物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入0.25mol／L硫酸1mL和甲醇2mL，渦動2min，在20～25℃、3 000r／min以上離心5min；取200μL上清液加入600μL復溶液（用去離子水將2×濃縮復溶液按1∶1體積進行稀釋），渦動20s，用于分析。

1.4 樣品檢測

1.4.1 ELISA將所需試劑放于20～25℃平衡30min以上，使用前搖勻。加標準品／樣本20μL到對應的微孔中，每孔加入酶標二抗濃縮液與抗體工作液（10∶1）的混合液80μL，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應30min。然后小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌液250μL／孔充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干，加底物液A液50μL／孔，再加底物液B液50μL／孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光反應10min，加入終止液50μL／孔，輕輕振蕩混勻，用酶標儀于450nm處測定。

1.4.2 CMIA將所有試劑回升至20～25℃，酶標抗原濃縮液與酶標抗原稀釋液按1∶10體積進行稀釋，磁標抗體濃縮液與磁標抗體稀釋液按1∶10體積進行稀釋，將稀釋好的磁標抗體與酶標抗體工作液裝入試劑盒標示區，再把樣品和標準品分別放入樣品管和標準品管，并放于磁免疫全自動化學發光檢測儀設定區域進行檢測。

1.5 標準曲線繪制及萊克多巴胺濃度的計算

測定0μg／L、0.05μg／L、0.15μg／L、0.45μg／L、1.35μg／L和4.05μg／L 6個濃度標準液的吸光度值（A）和發光度值（RLU），計算百分吸光率。

百分吸光率＝B／B0×100%

式中，B為標準品或樣品溶液的平均吸光度值，B0為標準溶液的平均吸光度值。

以萊克多巴胺濃度對數值（Log）為橫坐標，各對應濃度的百分吸光率為縱坐標，制作標準曲線；以萊克多巴胺標準品濃度的對數（Log）為橫坐標，ln百分吸光率為縱坐標建立雙對數直線擬合曲線，數學模型：

將樣品的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣品所對應濃度（C），乘以其對應稀釋倍數即為樣品中萊克多巴胺的實際濃度。

1.6 試劑盒性能檢測

分別對試劑盒的特異性、檢測限、精密度和準確度進行試驗，并將其精密度和準確度與HPLC檢測的精密度和準確度進行對比。

1.6.1 特異性 用交叉反應率來表示，即抗體與結構不同抗原決定簇發生結合的能力。選擇與萊克多巴胺類似結構和功能的藥物，將不同濃度的萊克多巴胺類似物替代萊克多巴胺標準溶液，根據其標準曲線，并計算交叉反應率。

交叉反應率＝引起50%抑制的萊克多巴胺濃度／引起50%抑制的萊克多巴胺類似物濃度× 100%

1.6.2 檢測限 分別對空白豬肉、豬肝和尿液樣品進行20次檢測，計算萊克多巴胺的濃度。檢測限（LOD，即試劑盒檢測實際樣品的最低檢測限）公式：

式中，X為萊克多巴胺的濃度平均值，SD為標準差。

1.6.3 精密度和準確度 精密度又稱可重復性，反映測定方法對某一特定樣品多次測定所得結果的重復程度，是評定化學發光試劑盒質量最基本的參數。準確度是指測定值與真實值間的符合程度，試劑盒的準確度用回收率表示。在檢測為陰性的豬肉、豬肝和尿液樣本中添加萊克多巴胺，每種樣品、每個濃度各6個平行，參照試劑盒說明書測定。抽取3批試劑盒，每批試劑盒測定同一份樣品2次，分別計算測定樣品的回收率。

1.6.4 試劑盒與GC－MS檢測結果比較 隨機抽取屠宰場的豬肉、豬肝和尿液樣本各20份，分別用試劑盒方法和GC－MS法進行檢測，GC－MS法參考農業部958號公告－4－2007動物組織及尿液中萊克多巴胺殘留檢測方法。GC－MS法中豬肉和豬肝（5μg／kg）、尿液（2μg／kg）的檢測限為陽性判定線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

從圖示可知，ELISA標準曲線的回歸方程y＝－1.782 8x＋4.224 9，R2＝0.996 2，說明萊克多巴胺ELISA檢測試劑盒線性關系良好。CMIA標準曲線的回歸方程y＝－1.725 4x＋4.149 4，R2＝0.997 5，說明萊克多巴胺CMIA檢測試劑盒線性關系良好。

2.2 試劑盒性能

2.2.1 特異性 從表1可知，萊克多巴胺類似代謝物的交叉反應率均較低，抗體特異性較高，對萊克多巴胺具有較好的特異性。

圖示ELISA（上）和CMIA（下）的標準曲線及其方程Fig. The standard curve and equation of ELISA（up）and CMIA（down）

表1 萊克多巴胺類似物的交叉反應率Table 1 Cross reactivity of ractopamine analogues%

表2 萊克多巴胺試劑盒的最低檢測限Table 2 Minimum detection limit of ractopamine kits

2.2.2 檢測限 從表2看出，ELISA和CMIA試劑盒對豬肉、豬肝和尿液3種樣品的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg，均低于目前歐盟對萊克多巴胺檢測方法的靈敏度（1μg／kg）［11］，說明這2種試劑盒檢測限較低，試劑盒靈敏度較高。

表3 萊克多巴胺試劑盒的準確度與精密度Table 3 Precision and accuracy of ractopamine kits

表4 不同方法檢測的萊克多巴胺含量Table 4 Ractopamine contents detected with different methodsμg／kg

2.2.3 精密度和準確度 從表3可知，3種樣品的回收率在90.4%～103.4%，變異系數均小于10%，符合“農業部文件”農醫發［2005］17號附件2中試劑盒備案的參考標準。

2.2.4 試劑盒與GC－MS法檢測比較 對隨機抽取屠宰場的豬肉、豬肝和尿液樣本各20份進行檢測，其中7號、12號樣本的萊克多巴胺（表4）高于檢出線，其他樣本無檢出。ELISA、CMIA試劑盒檢測結果與GC－MS法檢測結果相當，表明這2種試劑盒檢測的準確度達到國家標準檢測水平。

3 結論

測定結果表明，ELISA和CMIA檢測試劑盒對萊克多巴胺類似物的交叉反應率很低，對萊克多巴胺的特異性很高。ELISA和CMIA試劑盒對豬肉、豬肝和尿液樣品中萊克多巴胺的最低檢測限分別為0.28μg／kg、0.33μg／kg和0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg和0.20μg／kg；在萊克多巴胺0.5μg／kg和1.0μg／kg 2個水平的平均回收率為90.4%～103.4%，變異系數均小于10%；且2種試劑盒所需的檢測時間短，僅需少量儀器，檢測準確度達到國家標準檢測水平，適合大批量樣品檢測。

［1］萬 剛.一種β－興奮劑——萊克多巴胺的合成研究［D］.濟南：山東大學，2006.

［2］翟福麗，賴克強，張衍亮，等.動物性食品中β－興奮劑殘留概述［J］.食品科學，2011（5）：351－356.

［3］Smith D J.The Pharmacokinetics，Metabolism，and Tissue Residues ofβ－Adrenergic Agonosts in Livestock Journal of Animal science［J］.1998，76（1）：173－194.

［4］于洪俠.萊克多巴胺酶聯免疫吸附法（ELISA）的建立［D］.北京：中國農業科學院，2005.

［5］王培龍.β－受體激動劑及其檢測技術研究［J］.農產品質量與安全，2014（1）：44－52.

［6］高 照，張 援，張亦農，等.動物組織內殘留β2－受體激動劑的檢測方法研究進展［J］.中國運動醫學雜志，2014（4）：370－378.

［7］Shappell N W，Feil V J，Smith D J，et al.Response of C2C12mouse and turkey skeletal muscle cells to the beta－adrenergic agonist ractopamine［J］.Journal of Animal Science，2000，78（3）：699－708.

［8］Smith D J，Shelver W L.Tissue residues of ractopamine and urinary excretion of ractopamine and metabolites in animals treated for 7days with dietary ractopamine［J］.Journal of Animal Science，2002，80（5）：1240－1249.

［9］張海棠，王自良，王艷榮，等.萊克多巴胺的毒性及其殘留免疫學檢測技術研究進展［J］.安徽農業科學，2006（18）：4534－4536.

［10］左曉磊，邱 偉，韓愛云，等.萊克多巴胺在畜禽生產中的應用及殘留［J］.中國畜牧獸醫，2007（9）：12－14.

［11］蔣志偉，卜仕金，張雨梅，等.萊克多巴胺對鼠的毒性研究［J］.獸藥與飼料添加劑，2001（6）：4－6.

［12］李小麗，蔡 純，陳胤瑜，等.國內外動物源性食品獸藥殘留法規標準研究［J］.中國乳品工業，2011（8）：37－39.

［13］農業部，衛生部，國家藥品監督管理局.禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄［J］.河北畜牧獸醫，2002（5）：44－45.

［14］時冉冉，姜 波，王 濤.萊克多巴胺的檢測方法及注意事項［J］.中國畜牧獸醫文摘，2013（4）：36－37.

［15］王雪霞，劉曉云，彭運平.萊克多巴胺殘留檢測方法及其進展［J］.現代食品科技，2010（9）：1009－1012.

（責任編輯：馮 衛）

Rapid Detection of Ractopamine in Pork Tissues and Urine

DAND Juan1，LI Ping1，NIU Zhicun1，WANG Damin1，HE Guoshu1，2，FENG Caiwei1
（1.Guizhou Kwinbon Food Safety Science－Technology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou550009；2.Beijing Kwinbon Biotechnology Co.，Ltd，Beijing100012，China）

To realize the rapid detection of large－quantity samples of ractopamine residue in pork tissues，the methods of ELISA and CMIA were used to detect the residues of ractopamine in three kinds of samples including pork，liver and urine，which were compared with that of Gas Chromatography－Mass Spectrometer（GC－MS）.Results：The average recovery rate of ELISA and CMIA for detecting ractopamine in pork，liver and urine at levels of 0.5μg／kg and 1.0μg／kg reached 90.4%～103.4%with variation coefficient less than 10%；The minimum detection limits of pork，liver and urine were respectively 0.28μg／kg，0.33μg／kg and 0.12μg／kg，0.45μg／kg、0.50μg／kg and 0.20μg／kg；The judgments of ELISA and CMIA were the same as GC－MS.This method was efficient，reliable and sensitive，and could can meet the on－site rapid detection of animal tissue and urine ractopamine residues needs.

ractopamine；melamine enzyme－linked immune sorbent assay（ELISA）；chemiluminescent microparticle immunoassay（CMIA）；gas chromatography－mass spectrometer（GC－MS）

S859.84

A

1001－3601（2016）08－0340－0061－04

2016－02－16；2016－07－07修回

2015貴州省科技廳農業公關項目“農產品質量安全控制技術集成研究與應用示范”［黔科合NY（2015）3016－1］；2014貴州省科技成果轉化引導基金計劃項目“動物源性食品中獸藥殘留酶聯免疫檢測產品產業化及推廣應用”［黔科合成轉字（2014）5104］

黨 娟（1989－），女，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測技術的研究與開發工作。E－mail：853625823＠qq.com