擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析

杜亞琳

（農業部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，東北農業大學園藝學院，哈爾濱150030）

擬南芥缺銅敏感突變體的鑒定分析

杜亞琳

（農業部東北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，東北農業大學園藝學院，哈爾濱150030）

為進一步探明植物缺銅響應機制，利用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變、體視顯微形態觀察和ICP－MS技術對擬南芥（Col）缺銅敏感突變體cds－1進行鑒定分析。結果表明：在缺銅條件下，cds－1的根伸長發育受到抑制，而高濃度銅處理則可使得cds－1根長部分恢復至野生型。除根伸長發育受到抑制外，cds－1根部形態（根毛長度和根直徑）與野生型相比也有較大差異。cds－1與野生型植株體內銅含量無顯著差異。遺傳分析該突變體性狀由2對隱性等位基因控制。

突變體；擬南芥；銅；EMS

銅是植物生長和發育必需的微量元素，諸多代謝過程，如光合作用、線粒體電子傳遞、呼吸作用、活性氧代謝、細胞壁結構改變及乙烯反應等，均需要銅作為輔助因子［1－2］。由于其在發育過程中的重要意義，銅動態平衡在植物體內處于精細調控狀態。植物體內銅濃度在不同物種及不同外源銅環境條件下存在差異［3］。植物體內，銅濃度一般為2～50μg／g，而6μg／g銅濃度足以保證植物正常的生長和發育。然而當銅濃度低于5μg／g或高于20μg／g時，植物體表現缺銅或銅毒害癥狀［2］。缺銅癥狀在不同土壤類型和作物中表現有所差異，但在有機質土壤生長的植物易表現缺銅癥狀，如生長速率減緩、葉片顏色變淡、花粉活力減弱、結實率和產量降低等。

缺銅脅迫條件下，植物通過調控銅吸收和轉運已經演化獲得1個精細調控體內銅動態平衡的機制［45］。如擬南芥通過提高銅的吸收和獲取應對缺銅脅迫。缺銅脅迫上調擬南芥銅轉運蛋白基因的表達，如ZIP2、ZIP4和FRO3等［6－7］。此外，缺銅脅迫時，在轉銅伴侶CCH作用下，在衰老過程中銅在各組織間重新分配［8］。植物的另一個缺銅響應機制為改變銅在體內的分配，此機制在萊茵衣藻中研究較深入［9］，然而擬南芥分配機制與萊茵衣藻不同。在缺銅條件下，擬南芥銅鋅超氧物歧化酶CSD1和CSD2，及轉銅伴侶CCS均下調表達，且呈共表達模式［6，10］。隨著CSD1和CSD2在缺銅脅迫下的下調表達，鐵超氧物歧化酶基因FSD1表達增加，進而取代Cu／ZnSOD的功能，節余的銅將用于缺銅脅迫條件下植物最必須的功能代謝過程［3，10］。銅相關microRNA的鑒定有利于進一步理解植物的缺銅響應機制。Cu－miroRNA受到低銅誘導表達和高銅抑制表達，而Cu－miroRNA下調表達介導的銅動態平衡，主要受關鍵作用因子miR398的調控，而miR398只在低銅環境中表達。在缺銅脅迫下，miR398能夠直接調控CSD1mRNA的降解，同時，其還調控CSD2和COX5b－1的表達［11］。此外，另外3個低銅上調表達microRNA家族，miR397、miR408和miR857，同樣可調控銅蛋白基因的表達［12］。

植物缺銅響應機制的相關研究已取得較大進展，但目前銅脅迫條件下植物調控銅動態平衡的生理與分子機制仍不能清晰闡述，而突變體材料則是研究植物缺銅適應機制的理想材料。van Vliet等［13］獲得1個銅富集敏感突變體cup1－1，該突變體體內植物螯合態的生物合成及功能未受到影響，可能是體內積累了過量銅而使其擁有銅富集敏感表型。Murphy和Taiz［14］利用VMT技術快速鑒定獲得1個擬南芥銅富集敏感突變體cus。在EMS誘變基礎上，Wu等［15］獲得了1個缺銅敏感突變體tpst－2，酪氨酸硫化轉移酶基因內含子保守可變剪切位點的突變導致該突變性狀的產生，生理生化及蛋白質水平試驗證據表明，該基因可能參與銅介導的乙烯信號傳導途徑。筆者從甲基磺酸乙酯（EMS）誘變獲得的擬南芥（哥倫比亞型，Col）M2代群體中篩選擬南芥缺銅敏感突變體，以期為后續利用基因工程技術研究該基因的功能及探索植物缺銅響應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥（Arabidopsis）生態型為哥倫比亞型（野生型，WT）。EMS誘變的擬南芥WT型M2種子購自于美國Lehle種子中心。種子經0.1%HgCl2消毒5min后，用無菌水沖洗3～4次，然后用0.1%的瓊脂懸浮于MGRL培養基［15］，于4℃條件下黑暗處理2d后轉至光照為100μmol／（m2·s）、光照／黑暗為16h／8h光周期、溫度為22℃的光照培養箱進行培養。培養基采用MGRL配方：1.512mmol／L NaH2PO4·2H2O，0.257mmol／L Na2HPO4· 12H2O，1.5mmol／L MgSO4·7H2O，2mmol／L Ca （NO3）4·4H2O，3mmol／L KNO3，67μmol／L Na2EDTA·2H2O，8.6μmol／L FeSO4·7H2O，10.3μmol／L MnSO4，1μmol／L ZnSO4·7H2O，30μmol／L H3BO3，24nmol／L（NH4）6Mo7O24· 4H2O，130nmol／L CoCl2·6H2O，分別在培養基中添加不同濃度的CuSO4，0和50μmol／L分別為缺銅（－Cu）和高銅（50Cu）。

1.2 突變體的篩選

以野生型種子作為對照，將由EMS誘變的擬南芥WT型2 000粒M2代種子播種于缺銅培養基上，處理5d后將根伸長發育受到抑制的單株轉移至高銅培養基生長，5d后將根伸長發育部分或完全恢復至野生型單株再次轉移至缺銅培養基，根伸長發育再次受到缺銅抑制的單株作為潛在的擬南芥缺銅敏感突變體并自交繁種。將M3種子再次在缺銅和高銅培養基中進行篩選和驗證，最終鑒定具有顯著缺銅敏感的突變體（命名為csd－1）。

1.3 擬南芥植株根長測定

將野生型和突變體種子消毒后置于4℃黑暗培養2d，然后分別播種于缺銅和高銅培養基上生長10d（光照為100μmol／（m2·s）、16（光照）／8（黑暗）h光周期、溫度為22℃），利用軟件ImageJ（http：／／rsb.info.nih.gov／ij／）測定植株根長，每個處理不少于30個單株，統計分析采用Turkey法進行（P＜0.05）。

1.4 銅含量測定

將野生型和突變體種子消毒后置于4℃黑暗培養2d，然后植株分別播種于缺銅和高銅培養基上生長10d（光照為100μmol／（m2·s）、光照／黑暗為16h／8h光周期、溫度為22℃），分地上部和根分別取材，用蒸餾水將樣品沖洗3次后置于65℃烘干，并用硝酸硝解。樣品銅含量采用ICP－MS （SPQ9700；SII，Chiba，Japan）測定［16］。

1.5 突變體的體視顯微形態學觀察

將突變體和野生型種子分別播種2個處理（缺銅和高銅培養基）生長7d，取其根部，利用體視顯微鏡（SteREO Discovery.V12）進行體視顯微形態學觀察，每個處理不少于10株植株。

1.6 突變體的遺傳分析

將csd－1突變體與Ler野生生態類型進行雜交，以獲得F1代種子，進而將F1自交收獲F2種子。將F1種子和F2種子播種于缺銅培養基上觀察F1及F2植株的缺銅敏感性及分離比例。

2 結果與分析

2.1 擬南芥銅缺失敏感突變體cds－1的篩選及表型

經鑒定得1株擬南芥銅敏感突變體，命名為cds－1（圖1A）。在缺Cu條件下生長10d，野生型根長為（8.1±0.25）cm，cds－1根長為（3.2±0.27）cm；而在高銅條件下，野生型根長為（7±0.31）cm，cds－1根長為（5.3±0.1）cm（圖1B）。經形態學觀察得，cds－1突變體在缺銅條件下主根變粗，側根數量和長度均有所增加；高銅處理對野生型的根部形態無影響，但卻能部分恢復cds－1突變體的根部形態（圖2），表明，cds－1是擬南芥銅缺失敏感突變體。在缺銅和高銅條件下，野生型和cds－1突變體的地上部和根銅含量均無顯著性差異（圖3）。

圖1 擬南芥缺銅敏感突變體cds－1及其野生型植株的根長Fig.1 The root length of Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

圖2 擬南芥缺銅敏感突變體cds－1及其野生型植株的根組織形態Fig.2 Stereo microscope morphological observation of root tissue of Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

圖3 擬南芥銅敏感突變體cds－1及其野生型的銅含量Fig.3 Cu content of the Cu deficiency sensitive mutant cds－1and wild type plants

2.2 擬南芥銅缺失敏感突變體cds－1的遺傳特征

經遺傳分析，30株F1植株全部為野生型表型，在F2植株中有670株表現為野生型表型，46株植株表現為突變表型，野生型∶突變體＝15∶1，表明該突變性狀由2對隱性等位基因控制。

3 結論與討論

突變體是功能基因組學研究的重要材料。隨著各種植物全基因組測序工作的陸續完成，植物突變體已廣泛應用于鑒定調控植物形態和生理性狀與基因的連鎖分析及其相關基因的克隆和功能研究。目前，應用于突變體獲得的方法有多種，EMS誘變是其中效率較高的技術［17］。此外，針對EMS誘變特點，結合基因組重測序技術，開發了各種新型的用于鑒定EMS誘變突變體目標基因的技術，如結合重測序和圖位克隆進行基因的鑒定、利用F2分離群體進行基因鑒定的MutMap技術和利用M3分離群體進行基因鑒定的MutMap＋技術等［17－19］，為下一步克隆控制擬南芥缺銅敏感突變體目標基因提供了技術支持。

鑒于cds－1突變體是經EMS誘變產生的擬南芥銅缺失敏感突變體。據植物銅吸收和銅調控植物生長發育的信號傳導途徑［4－5］，突變體對缺銅生長條件產生敏感性，可能是由于其某個負責銅吸收、轉運的基因發生了突變，或因其某個負責銅生理功能發揮的信號傳導基因發生突變。為闡明此問題，測定野生型及cds－1突變體的銅含量結果顯示，在缺銅和高銅條件下野生型和cds－1突變體的地上部和根銅含量均無顯著性差異，表明，cds－1突變基因不是負責銅吸收相關基因，可能是負責突變體內銅的利用或銅歸宿性轉運得相關基因。目前，cds－1基因的圖位克隆工作正在進行中，該基因的克隆可為進一步闡明植物缺銅敏感的分子調控機理提供基礎。

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（責任編輯：劉忠麗）

Identification and Analysis of Copper Deficiency Sensitive Mutant in Arabidopsis

DU Yalin

（Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（Northeast Region），Ministry of Agriculture，College of Horticultural，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang150030，China）

To understand the Cu deficiency response mechanism in plants further，a Arabidopsis（Col）copper deficiency（－Cu）sensitive mutant named cds－1was screened and identified by using ethyl methane sulfonate（EMS）mutagenesis，cytology and ICP－MS technique.Results：The root length elongation of cds－1was inhibited under－Cu condition，while it could be partially restored to the wild type phenotype under high Cu conditions.The length of root hair and root diameter of cds－1mutant were also different from the wild type phenotype under－Cu condition.Cu assay results showed that the cds－1mutant and Col plants had similar root and shoot Cu content.Genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by two recessive genes.

mutant；arabidopsis；copper；EMS

Q944.1

A

1001－3601（2016）08－0345－0080－04

2016－01－11；2016－07－21修回

黑龍江省青年科學基金項目“黃瓜耐低氮相關基因表達譜分析及重要基因克隆”（QC2010089）

杜亞琳（1980－），女，實驗師，碩士，從事園藝作物生物技術研究。E－mail：duyalin123＠163.com