亳州疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分及抗氧化與抑菌活性

丁 銳，榮百玲，2，王 珊，2，丁連峰，劉超祥＊，劉耀武

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽亳州236800；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230000；3.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限責(zé)任公司，安徽亳州236800）

亳州疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分及抗氧化與抑菌活性

丁 銳1，榮百玲1，2，王 珊1，2，丁連峰3，劉超祥1＊，劉耀武1

（1.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽亳州236800；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230000；3.安徽濟(jì)人藥業(yè)有限責(zé)任公司，安徽亳州236800）

為探明疏毛羅勒治療蚊蟲叮咬引起痛癢的原理，利用乙醚浸漬法提取疏毛羅勒弱極性成分，采用氣－質(zhì)聯(lián)用法對(duì)疏毛羅勒弱極性的化學(xué)成分，DPPH·清除能力測(cè)定法和O－2·清除能力測(cè)定法研究其抗氧化活性，杯碟法進(jìn)行抑菌活性研究。結(jié)果表明：疏毛羅勒弱極性組分共檢出26種成分，鑒定出化學(xué)成分的質(zhì)量占總量81.45%，其主要化學(xué)成分是乙酰小茴香酯（29.26%）、1，2，3，4，5，6，7，8－八氫－1，4－二甲基－7－（1－亞異丙基）－甘菊環(huán)烴（7.24%）、莰烯（2.95%）等；弱極性成分對(duì)DPPH·和O－2有中等程度的清除能力；其對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及白色念珠菌4株菌種有抑菌作用，且濃度越高，抑菌效果越明顯。

疏毛羅勒；化學(xué)成分；抗氧化性；抑菌活性

疏毛羅勒（Ocimum basilicum）為唇形科羅勒屬一年生全草植物，別名蘭香、九層塔等；其味辛、甘、性溫，有疏風(fēng)解表、化濕和中、行氣活血和解毒消腫之功效。主治感冒頭痛、發(fā)熱咳嗽、中暑、食積不化等癥［1－2］，還用于蛇蟲咬傷，濕疹騷癢，且無毒、無副作用。近年來，羅勒的化學(xué)成分和生物活性研究引起國內(nèi)外科研工作者的關(guān)注，藥理學(xué)研究主要集中在降低血糖活性、抗應(yīng)激作用、抗輻射引起的染色體損傷、驅(qū)蟲活性、治療腹瀉及抗真菌活性等領(lǐng)域［3－4］。

對(duì)亳州疏毛羅勒（變種，俗稱香花子）的實(shí)地調(diào)研發(fā)現(xiàn)，疏毛羅勒在驅(qū)蚊和對(duì)蚊蟲叮咬引起的痛癢和炎癥有特殊療效。對(duì)亳州疏毛羅勒弱極性成分臨床觀察發(fā)現(xiàn)，其對(duì)蚊蟲叮咬引起的痛癢療效明顯優(yōu)于精油，目前，對(duì)其原理尚無研究報(bào)道。因此，筆者對(duì)亳州地區(qū)疏毛羅勒弱極性的化學(xué)成分、抗氧化及抑菌活性進(jìn)行研究，試圖探明疏毛羅勒弱極性成分、抑菌活性、抗氧化活性與蚊蟲叮咬引起痛癢之間的關(guān)系，為弄清疏毛羅勒治療蚊蟲叮咬引起痛癢的原理，為其進(jìn)行深入研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 試驗(yàn)樣品采自安徽省亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為亳州疏毛羅勒。

1.1.2 儀器及試劑RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、FA2004N電子天平（上海菁海儀器有限公司）、752紫外可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、SHZ－（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）、HH－1數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶波實(shí)驗(yàn)儀器廠常州普天儀器制造有限公司）、456－GC型氣相色譜（美國Bruker公司生產(chǎn)）、SCION單四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國Bruker公司生產(chǎn)）、SPX－150B生化培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、MJX－160B霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、HPX－9082MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）和AR5120電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）。10mL具塞試管、250mL錐形瓶、150mL錐形瓶、1mL刻度吸管、10mL容量瓶、5mL容量瓶、2mL容量瓶和膠頭滴管；羥甲基氨基甲烷、DPPH·、抗壞血酸（Vc）、鄰苯三酚、0.9%無菌氯化鈉溶液、丙酮，所用試劑均為分析純。

1.1.3 菌株及培養(yǎng)基 大腸埃希菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和白色念珠菌（Candida albicans），營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁（瓊脂）培養(yǎng)基和氯化鈉蛋白胨緩沖液（pH 7.0），均由安徽濟(jì)人藥業(yè)有限責(zé)任公司檢測(cè)中心提供。

1.2 樣品處理

取疏毛羅勒新鮮全草適量，去除雜質(zhì)后洗凈，晾至表面無水分［5］，稱取200g粉碎后，加250mL乙醚浸泡24h，過濾得乙醚上清液，投入3g活性炭靜置24h，過濾活性炭后上清液即得乙醚，回收備用。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 氣相色譜條件BR－17型彈性毛細(xì)管色譜柱（0.25μm×0.250mm×30m）；載氣：高純氦氣（南京上元工業(yè)氣體廠），純度大于99.999%；柱流量1.0mL／min；采用分流進(jìn)樣，分流比10∶1；進(jìn)樣量1.0μL，進(jìn)樣口溫度為220℃；程序升溫條件：初始溫度為40℃（2min），以2℃／min的速度升溫至100℃后保持2min，再以5℃／min的速度升溫至250℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件與方法EI離子源，電子能量70eV；離子源溫度為220℃；傳輸線溫度為260℃；四級(jí)桿溫度為40℃。全掃描模式；掃描范圍，m／z 50～500；質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫，NIST 11.L；總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索按各色譜峰的質(zhì)譜裂片圖并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)峰質(zhì)荷比和相對(duì)豐度等進(jìn)行直觀比較，同時(shí)還對(duì)一些主要成分采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照，分別確認(rèn)各色譜峰，鑒定疏毛羅勒弱極性組分中化學(xué)成分，按面積歸一法確定各組分相對(duì)含量。

1.4 抗氧化活性測(cè)定

1.4.2 清除DPPH·自由基能力 配置不同濃度的樣品醇溶液，向1mL DPPH·乙醇溶液中加入樣品至總體積達(dá)2mL。振蕩器混勻后，室溫，避光放置30min后，在518nm處測(cè)定吸光度A1，DPPH·乙醇溶液在518nm處測(cè)定吸光度A0，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。用Vc進(jìn)行空白對(duì)照［6］。

清除率＝（A0－A1）／A0×100%；其中A0為（DPPH·乙醇溶液）的吸光值；A1為（DPPH＋樣品液）的吸光值

1.5 抑菌活性

采用杯碟法［7］，檢測(cè)疏毛羅勒揮發(fā)油對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑制作用。樣品設(shè)5個(gè)濃度，分別為900μg／mL、450μg／mL、225μg／mL、112.5μg／mL和56.25μg／mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 疏毛羅勒弱極性的化學(xué)成分

經(jīng)GC／MS分析，共檢測(cè)出26個(gè)峰。由表1可知，疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分中共有26種成分；其中脂類占比重最大，為39.54%，其他成分含量較少，依次為烯類（12.23%）、環(huán)烴（8.6%）、醇類（8.52%）、醛類（3.56%）、薁類（2.82%）、烷類（2.27%）、苯類（2.32%）和炔類（1.59%）。結(jié)合植物生源代謝途徑分析，疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分主要通過甲戊二羥酸代謝合成途徑、莽草酸代謝合成途徑和乙酰－丙酮酸代謝合成途徑完成，未發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝合成途徑產(chǎn)物。

2.2 疏毛羅勒弱極性的抗氧化活性

由表2可得，疏毛羅勒弱極性具有一定的清除DPPH·自由基的能力，但其清除能力較Vc弱，即抗氧化作用較Vc弱，而Vc的清除能力隨濃度減小，其抗氧化作用也逐漸降低。疏毛羅勒弱極性對(duì)于超氧陰離子具有一定的清除能力，其清除能力隨濃度的變化影響較小，但在一定范圍內(nèi)波動(dòng)。

表1 疏毛羅勒的弱極性化學(xué)成分Table 1 Weak polar chemical composition in O.basilicum

表2 疏毛羅勒弱極性的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of weak polar composition in O.basilicum

2.3 疏毛羅勒的抑菌活性

由表3可見，疏毛羅勒弱極性樣品有一定抑菌作用，隨著弱極性成分濃度增大，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌作用增強(qiáng)，且成濃度依賴關(guān)系。

表3 疏毛羅勒不同濃度弱極性成分的抑菌活性Table 3 Inhibitory activities of weak polar composition in O.basilicum

3 結(jié)論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展與自由基導(dǎo)致的機(jī)體細(xì)胞氧化損傷密切相關(guān)，從天然產(chǎn)物中尋找安全有效的抗氧化劑成為近年的研究熱點(diǎn)之一。本研究以抗DPPH·自由基能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分的抗氧化能力。通過疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分抗氧化性與Vc的IC50值對(duì)比發(fā)現(xiàn)，疏毛羅勒弱極性化學(xué)成分有較好的抗氧化性［8－9］；此前胡爾西丹等［8］測(cè)定的羅勒子揮發(fā)油具有抗氧化性，與本課題組試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著弱極性成分濃度增大，對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌作用增強(qiáng)，試驗(yàn)過程中將其制成液體溶劑用于蚊蟲叮咬試驗(yàn)，止癢效果也較明顯。筆者課題組從疏毛羅勒弱極性組分中分離純化到1個(gè)具有驅(qū)蚊活性的單體化合物和1個(gè)具有止癢效果的單體化合物，2個(gè)化合物的藥理活性正在進(jìn)一步研究和開發(fā)。

［1］劉勇民.維吾爾藥志［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：336－338.

［2］國家中醫(yī)藥管理局，中華本草編委會(huì).中華本草［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

［3］周緒霞，李衛(wèi)芬.羅勒的應(yīng)用與展望［J］.中草藥，2003，25（2）：25－26.

［4］劉超祥，方成武，劉耀武.羅勒化學(xué)成分與抗氧化活性影響因素研究進(jìn)展［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6）：51－55.

［5］胡云飛，吳德玲，徐國兵，等.GC－MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)5個(gè)產(chǎn)地牡丹皮提取物的比較分析［J］.中草藥，2015，37（9）：2003－2007.

［6］LIU Chao－Xiang，LIN Zhong－Xiang，LU Zhou，et al.Antitumor and scavenging radicals activities of some polyphenols related to dehydroabietylamine de－rivatives［J］.Journal of Asian Natural Products Research，2013，15（8）：819－827.

［7］楊春杰，丁連峰，劉超祥，等.婦科止帶片微生物限度檢查的方法學(xué)驗(yàn)證研究［J］.安徽醫(yī)藥，2014（3）：455－458.

［8］胡爾西丹，伊麻木，艾 薩.羅勒子揮發(fā)油成分及抗氧化活性分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：752－754.

［9］勾明玥，劉 梁，張春枝.采用DPPH法測(cè)定26種植物的抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（3）：148－150.

（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Antioxidant Activity and Antimicrobial Activity of Weak Polar Constituents in Ocimum basilicumin Bozhou

DING Rui1，RONG Bailing1，2，WANG Shan1，2，DING Lianfeng3，LIU Chaoxiang1＊，LIU Yaowu1
（1.Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou，Anhui 236800；2.Anhui Traditional Chinese Medicine University，Hefei，Anhui 230000；3.Anhui Jiren Pharmaceutical Industries Co.，Ltd，Bozhou，Anhui 236800，China）

To explore the treating principle of O.basilicumfor mosquito bites，weak polar chemical constituents in O.basilicumwere extracted by diethyl ether dipping method and the constituents were analyzed by GC－MS method.The antioxidant activity were assayed via scavenging properties of DPPH and O－2，the antibacterial activity were studied using the cup－plate method.Results：26kinds of components were indeed recognized in weak polarity constituent.The identified ingredients accounted for nearly 81.45%of weak polarity constituents，its main chemical composition is fenchyl acetate（29.26%），1，2，3，4，5，6，7，8－octahydro－1，4－dimethyl－7－（1－methylethylidene）－azulen（7.24%）and camphene（2.95%）.The weak polarity constituents have moderate activity for scavenging properties of DPPH and O－2.The constituents have also certain antibacterial activity against Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Bacillus subtilis and Candida albicans，and the higher the concentration，the more obvious the antibacterial activity.

Ocimum basilicum；chemical constituents；antioxidant activity；antibacterial activity

S567.9

A

1001－3601（2016）08－0349－0097－03

2016－03－01；2016－08－02修回

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目重點(diǎn)課題“疏毛羅勒鎮(zhèn)痛抗炎成分篩選及作用機(jī)制研究”（KJ2015A358）；亳州市創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)領(lǐng)軍人才科研團(tuán)隊(duì)“中藥保健品開發(fā)團(tuán)隊(duì)”（BZ2014zzb21）；安徽省質(zhì)量工程“藥學(xué)專業(yè)省級(jí)教學(xué)團(tuán)隊(duì)”（2013jxtd067）；安徽省質(zhì)量工程“藥品質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)特色專業(yè)”（2014tszy055）

丁 銳（1982－），男，助教，碩士，從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及生物活性研究。E－mail：dingrui020＠126.com

＊通訊作者：劉超祥（1972－），男，副教授，博士，從事天然產(chǎn)物化學(xué)成分及生物活性研究。E－mail：cxliu888＠163.com