鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的工藝優(yōu)化

張強，薄 惠，邢建華，王高峰

（黃河科技學院醫(yī)學院實驗中心，河南鄭州450063）

鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的工藝優(yōu)化

張強，薄 惠，邢建華，王高峰

（黃河科技學院醫(yī)學院實驗中心，河南鄭州450063）

為提高鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的產(chǎn)量，采用單因素和正交試驗對L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果表明：ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的最佳培養(yǎng)基組成為葡萄糖16g／100mL、蛋白胨0.25g／100mL、酵母粉1.0g／100mL、乙酸鈉0.3g／100mL、K2HPO40.1g／100mL、吐溫－80 0.1g／100mL、MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最適發(fā)酵條件為發(fā)酵時間72h，接種量10%，溫度37℃，轉速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。以該培養(yǎng)基為最適L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行發(fā)酵，在搖瓶水平上的L－乳酸產(chǎn)量為120g／L。進行5L發(fā)酵罐上罐發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸，產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉化為L－乳酸的轉化率為85.56%，L－乳酸的光學純度為95.39%。

鼠李糖乳桿菌；發(fā)酵；L－乳酸；優(yōu)化

乳酸按其旋光性可分為D－乳酸、L－乳酸和DL－乳酸，是一種重要的有機酸［1－2］。廣泛應用于醫(yī)藥、食品和環(huán)保等行業(yè)［3］。L－乳酸（L－lactic acid）是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于生產(chǎn)紅霉素林格氏液用于輸液。其中，L乳酸鈣、L乳酸鈉、L乳酸鋅和L乳酸亞鐵等藥物是補充金屬元素的良好藥品［4］。同時，L－乳酸還可用作手術室、病房和實驗室等殺菌消毒［4］。由于人體只能利用L－乳酸，且我國在L－乳酸的產(chǎn)量和質(zhì)量上不能滿足市場日益增長的需求，產(chǎn)品多為消旋的DL－乳酸，因此研究生產(chǎn)L－乳酸替代D－乳酸和DL－乳酸有著現(xiàn)實的意義和應用前景［5－7］。

張為巍等［8］對篩選得到的野生型鼠李糖乳桿菌CLRID10通過響應面試驗優(yōu)化后的L－乳酸產(chǎn)量達104.40g／L，吳暉等［9］通過正交試驗優(yōu)化后的L－乳酸產(chǎn)量達143.6g／L，但其研究均是在搖瓶水平上進行，沒有通過發(fā)酵罐放大進行L－乳酸發(fā)酵的參數(shù)優(yōu)化，也沒有對L－乳酸的光學純度進行分析。為此，筆者對野生型的鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并對發(fā)酵罐放大和L－乳酸光學純度進行分析，以期為L－乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）ZQ－55由黃河科技學院醫(yī)學實驗中心篩選、選育并保藏。

1.1.2 試劑 葡萄糖、碳酸鈣、吐溫－80、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O等試劑均為分析純（國藥集團），蛋白胨、酵母粉（英國OXOID公司），MRS肉湯（青島高科園海博生物技術有限公司），L－乳酸（山東省農(nóng)業(yè)科學院）。

1.1.3 儀器DU730型紫外分光光度計（美國Beckman公司），ZHWY－1102C雙層小容量恒溫搖床（上海智誠公司），SW－CJ－1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司），SBA－40D生物傳感分析儀（山東省科學院生物研究所），BLBIO－5SJA型5L自動發(fā)酵罐（上海百倫科技），GSP－9080MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 菌種培養(yǎng)

將甘油管內(nèi)的菌種溶解后接入100mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫過夜培養(yǎng)活化后，接種至100mL裝液量的L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150r／min恒溫震蕩培養(yǎng)。

1.3 單因素試驗考察

單因素試驗時，依次改變K2HPO4的添加量（0.1g／L、0.2g／L、0.3g／L、0.4g／L和0.5g／L）、不同的初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同的接種量（2.5mL／100mL、5.0mL／100mL、7.5mL／100mL、10.0mL／100mL、12.5mL／100mL、15.0mL／100mL、17.5mL／100mL和20.0mL／100mL）、不同的發(fā)酵時間（1d、2d、3d、4d、5d、6d 和7d）以及不同的中和劑（氫氧化鈣、碳酸鈣、氨水和碳酸氫鈉），以L－乳酸產(chǎn)量為評價指標，所有的梯度都設置3個平行的搖瓶試驗，然后取其平均值作為試驗測定結果。

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，通過4因素3水平的正交試驗［10－11］，考察L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、乙酸鈉、蛋白胨和酵母粉確定各組分的最佳用量，試驗設計的因素及水平見表1。以優(yōu)化后的最佳L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，在5L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的過程中，每隔2h取樣1次，分別測定殘?zhí)橇俊－乳酸產(chǎn)量和菌體OD600值，發(fā)酵72h結束。

表1 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal test of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid g／100mL

1.5 菌體OD值的測定

移取100μL發(fā)酵液稀釋至500倍，通過利用紫外分光光度計在600nm處測定菌體吸光度值。菌體的OD600值為OD600×稀釋倍數(shù)。

1.6 L－乳酸的測定與分析

取100μL的發(fā)酵液稀釋至400倍，8 000r／min離心1min，利用生物傳感分析儀測定L－乳酸的產(chǎn)量。乳酸的光學純度采用手性分離色譜柱，通過高效液相色譜法測定。首先移取150μL的L－乳酸發(fā)酵液稀釋至100倍，然后用0.22μm濾膜過濾，L－乳酸光學純度的分析測定條件設定：Chiralpak AD型手性異構分離柱，流動相為2mmol／L CuSO45%異丙醇，流速為1mL／min，紫外檢測波長為236nm，柱溫為30℃［12］。

1.7 5L發(fā)酵罐試驗

以優(yōu)化的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配置5L發(fā)酵罐的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液初始裝液量為2.5L。初始葡萄糖濃度為160g／L，發(fā)酵到50h時添加140g質(zhì)量分數(shù)為50%的葡萄糖溶液，pH用50%的NaOH溶液調(diào)節(jié)，pH調(diào)節(jié)采用發(fā)酵罐自動控制，低于4.5時自動添加堿以調(diào)節(jié)pH，吐溫－80作為緩沖劑時，要添加消泡劑，發(fā)酵過程中通高純氮氣，以保證嚴格厭氧發(fā)酵。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有的試驗都進行3次重復，然后取其平均值作為測定結果值，平均值和標準偏差分析用Microsoft Excel 2007軟件處理。圖形的繪制由Origin 7.5進行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)后完成。

2 結果與分析

2.1 不同因素下L－乳酸的產(chǎn)量

從圖1可知，不同發(fā)酵時間、接種量、初始pH、中和劑及K2HPO4添加量的L－乳酸產(chǎn)量變化。

2.1.1 發(fā)酵時間 發(fā)酵時間低于3d時，L－乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，當發(fā)酵時間超過3d時，L－乳酸的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而降低。可能是發(fā)酵培養(yǎng)時間過長時，菌體死亡率加大，導致微生物代謝能力降低，也可能是發(fā)酵時間過長，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)已接近消耗殆盡［13］，這時菌體利用代謝產(chǎn)物L－乳酸來維持基本生命的活動，最終導致L－乳酸產(chǎn)量降低。

2.1.2 接種量L－乳酸產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，當達到10mL時L－乳酸產(chǎn)量最大，為136g／L，而后隨著接種量的增加L－乳酸產(chǎn)量反而降低。當接種量在5～10mL時對L－乳酸產(chǎn)量影響較小，當大于10mL時，隨著接種量的增加L－乳酸產(chǎn)量降低，原因可能是接種量太大時，會使發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分不夠菌體生長與發(fā)酵，導致菌體死亡率增加，最終使L－乳酸產(chǎn)量降低［14］。

圖1 不同發(fā)酵時間、接種量、初始pH、中和劑和K2HPO4添加量的L－乳酸產(chǎn)量Fig.1 L－Lactic acid production of different fermentation time，inoculum size，initial pH，neutralization agent and K2HPO4

2.1.3 不同初始pH pH是影響發(fā)酵的重要因素之一，控制好pH使其處在適合菌體生長代謝的最佳pH范圍［12］。當起始pH低于7.0或高于7.0時，L－乳酸產(chǎn)量都較低，當起始pH控制在7.0時L－乳酸產(chǎn)量最高。這可能是當起始pH較低或較高時都會對菌體的生長代謝產(chǎn)生影響，可能會抑制菌體生長代謝生產(chǎn)L－乳酸［12，16］。由此得出發(fā)酵的起始pH 為7時最佳。

2.1.4 不同中和劑 由于乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生了大量的酸，使得發(fā)酵液的pH不斷降低，當發(fā)酵液的pH降到一定程度時不利于菌體的生長和代謝生產(chǎn)L－乳酸。所以，需在發(fā)酵液中加入中和劑，以此來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸［15］，使乳酸形成乳酸鹽溶解于發(fā)酵液中，這樣能夠不斷地緩沖發(fā)酵液pH的降低，從而有利于發(fā)酵液維持在適合菌體生長代謝的pH環(huán)境中。當中和劑選擇碳酸鈣時，L－乳酸的產(chǎn)量最高，而其他中和劑雖然能中和掉發(fā)酵液中的乳酸，但是這些中和劑溶解后都具有堿性，都會使溶液的pH大于7.0，而堿性環(huán)境不利于菌體的生長，會導致菌體大量死亡，所以其他的中和劑不適合在搖瓶水平上作為中和劑來調(diào)節(jié)發(fā)酵的pH并中和乳酸。

2.1.5 K2HPO4添加量 當K2HPO4添加量為1g／L時，L－乳酸的產(chǎn)量最高，當K2HPO4添加量超過2g／L時，L－乳酸產(chǎn)量不斷降低，可能是菌體在培養(yǎng)的過程中，一定范圍內(nèi)添加量的K2HPO4有助于菌體代謝生產(chǎn)乳酸，K2HPO4添加過量時不利于菌體進行乳酸發(fā)酵［16－17］。

2.2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的最佳發(fā)酵工藝

由表2可知，正交試驗各處理L－乳酸產(chǎn)量。對其進行極差分析，4因素對L－乳酸含量的影響依次為D＞C＞A＞B，即酵母粉＞蛋白胨＞葡萄糖＞乙酸鈉，酵母粉對乳酸產(chǎn)量影響最大。培養(yǎng)基組分的最佳組合為A3B2C1D2，即葡萄糖16g，乙酸鈉0.3g，蛋白胨0.25g，酵母粉1.0g。

通過單因素和正交優(yōu)化試驗，確定最佳的L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸鈉0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐溫－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。發(fā)酵時間72h，接種量10%，溫度37℃，轉速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。以該培養(yǎng)基為最適L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，L－乳酸產(chǎn)量為120g／L，是優(yōu)化前的1.85倍，表明確定的培養(yǎng)基組分和各組分添加量較為合適。

2.3 發(fā)酵罐上罐試驗結果

從圖2可知，發(fā)酵結束后L－乳酸產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉化為L－乳酸的轉化率為85.56%。對5L發(fā)酵罐放大發(fā)酵后的發(fā)酵液進行L－乳酸的光學純度分析發(fā)現(xiàn)（圖3），L－乳酸出峰時間為7.579min，峰面積為7922 239，D－乳酸的出峰時間為9.714，峰面積為382 704。經(jīng)計算，L－乳酸的光學純度為95.39%，比優(yōu)化前提高5.01%，同時優(yōu)化后的L－乳酸光學純度接近于相關文獻報道的L－乳酸的光學純度96%［12］。

表2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵產(chǎn)L－乳酸的正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test for fermentation medium optimization of L.rhamnosus ZQ－55producing L－lactic acid

圖2 鼠李糖乳桿菌ZQ－55在5L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中的物質(zhì)變化Fig.2 Material change of L.rhamnosus ZQ－55in the fermentation process in the 5Ltank

圖3 乳酸的光學純度色譜圖Fig.3 Chromatogram of the optical purity of lactic acid

3 結論與討論

采用單因素和正交試驗對野生型鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳培養(yǎng)基為葡萄糖16g／100mL，蛋白胨0.25g／100mL，酵母粉1.0g／100mL，乙酸鈉0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，吐溫－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL和MnSO4·H2O 0.05g／100mL。最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間72h，接種量10%，溫度37℃，轉速150r／min，裝液量為100mL，一次性添加碳酸鈣10g。利用5L發(fā)酵罐進行L－乳酸的發(fā)酵條件放大試驗，發(fā)酵結束后L－乳酸產(chǎn)量為160.5g／L，產(chǎn)L－乳酸速率為2.23g／（L·h），葡萄糖的總添加量為187g／L，糖轉化為L－乳酸的轉化率為85.56%，L－乳酸的光學純度為95.39%。

試驗的突破性在于利用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，在搖瓶水平上，L－乳酸產(chǎn)量達到120g／L，是優(yōu)化前的1.84倍。同時，通過5L發(fā)酵罐的放大發(fā)酵試驗，優(yōu)化出鼠李糖乳桿菌ZQ－55發(fā)酵罐放大發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的最適工藝參數(shù)，L－乳酸的光學純度達95.39%，接近于相關文獻［12］報道的L－乳酸的光學純度96%，該結果具有重要的生產(chǎn)實踐指導意義，也說明該菌株具有重要的工業(yè)應用價值。

［1］高年發(fā)，孫曉雯，許俊艷，等.細菌L－乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.中國釀造，2008，184（7）：30－32.

［2］Shengde Zhou，T B Causey，A Hasona，et al.Production of Optically Pure D－Lactic Acid in MineralSalts Medium by Metabolically Engineered Escherichia coli W3110［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）：399－407.

［3］Ayumu Onda，Takafumi Ochi，Koji Kajiyoshi，et al.A new chemical process for catalytic conversion of D－glucose into lactic acid and gluconic acid［J］.Applied Catalysis A：General，2008，343：49－54.

［4］王立梅，齊 斌.L－乳酸應用及生產(chǎn)技術研究進展［J］.食品科學，2007，28（10）：608－611.

［5］歐提庫爾，穆斯塔怕，張志東，等.L－乳酸的研究進展及其應用前景［J］.新疆化工，2005（3）：5－11.

［6］趙 鑫，趙良啟，謝 紅.發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的現(xiàn)狀與展望［J］.2005，25（1）：15－19.

［7］秦 浩，張偉國，葛向陽，等.高產(chǎn)L－乳酸干酪乳桿菌的選育及發(fā)酵條件研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32 （7）：223－225.

［8］張為巍，李元媛，周銘鋒，等.產(chǎn)L－乳酸的鼠李糖乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.廣州化工，2012，40（7）：79－82.

［9］吳 暉，李明陽，劉冬梅，等.鼠李糖乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2008，29 （4）：81－83.

［10］王東陽，蔡傳康，閆汝東，等.正交試驗優(yōu)化L－色氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（4）：1910－1911.

［11］吳亞麗，劉 冬，張麗君，等.正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基因工程菌（Ecoli／pGEX）產(chǎn)降血壓肽培養(yǎng)基的組成［J］.氨基酸與生物資源，2006，28（1）：76－79.

［12］SeKwon Moon，YoungJung Wee，Gi－Wook Choi.A novel lactic acid bacterium for the production of high purity L－lactic acid，Lactobacillus paracasei subsp.paracasei CHB2121［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，114（2）：155－159.

［13］張曉玲，陳歷俊，牟光慶.一株產(chǎn)胞外多糖枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.中國食品添加劑，2011（1）：181－185.

［14］孫 靚，孫菲菲，黃艷燕，等.木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸的培養(yǎng)條件優(yōu)化［J］.中國釀造，2009，28（7）：33－37.

［15］徐國謙，儲 炬，王永紅，等.不同的中和劑對L（＋）－乳酸發(fā)酵的影響［J］.工業(yè)微生物，2007，37（4）：1－4.

［16］Ying Meng，Yanfen Xue，Bo Yu，et al.Efficient production of L－lactic acid with high optical purity by alkaliphilic Bacillus sp.WL－S20［J］.Bioresource Technology，2012，116：334－339.

［17］金 樁，彭 健，胡新文，等.嗜酸乳桿菌－1.557培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成優(yōu)化研究［J］.飼料工業(yè)，2010，31 （2）：34－36.

（責任編輯：孫小嵐）

Optimization of L－lactic Acid Fermentation Conditions by Lactobacillus rhamnosus ZQ－55

ZHANG Qiang，BO Hui，XING Jianhua，WANG Gaofeng
（Experimental Center of Medical College，Huanghe University of Science and Technology，Zhengzhou，Henan450063，China）

To improve the L－lactic acid production by the L.rhamnosus ZQ－55，single factor experiments and orthogonal tests were used to optimize the fermentation medium and fermentation conditions of L.rhamnosus ZQ－55.The results showed that the optimum fermentation medium for L.rhamnosus ZQ－55was determined as follows：glucose 16g／100mL，peptone 0.25g／100mL，yeast extract 1.0g／100mL，sodium acetate 0.3g／100mL，K2HPO40.1g／100mL，Tween－80 0.1g／100mL，MgSO4·7H2O 0.02g／100mL、MnSO4·H2O 0.05g／100mL.Optimal fermentation conditions were as follows：inoculum size 10%，rotation speed was 150r／min，the fermentation was performed at 37℃for 72h，the medium volume was 100mL，CaCO3（10g／100mL）was used to control the pH value.Under the optimized conditions in flask fermentation，the L－lactic acid production was improved to 120g／L.Finally，fed－batch lactate fermentation by L.rhamnosus ZQ－55 was tested in 5－L fermenter，after 72hfed－batch fermentation，L.rhamnosus ZQ－55produced up to 160.5g／L L－lactic acid，with the yield of 85.56%（g L－lactic acid／g glucose），the productivity of 2.23g／（L·h），the optical purity of L－lactic acid was improved to 95.39%.

Lactobacillus rhamnosus；fermentation；L－lactic acid；optimization

Q939.99

A

1001－3601（2016）08－0355－0122－05

2016－01－09；2016－07－05修回

張 強（1980－），男，實驗師，碩士，從事微生物制藥工作。E－mail：2977331501＠qq.com