銀杏葉提取物EGb761對MPP+誘導的人腦神經瘤母細胞SH—SY5Y細胞損傷的影響

薛莉花 武興斌 連佛彥 潘劍

摘要：目的 觀察銀杏葉提取物EGb761對人腦神經瘤母細胞SH-SY5Y細胞損傷的影響，探討其作用機制。方法 采用細胞培養方法，建立SH-SY5Y細胞1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）損傷帕金森病體外模型。實驗分為對照組、模型組和中藥低、中、高劑量組，各給藥組給予相應劑量藥物。MTT法測定細胞存活率，AnnexinV凋亡檢測試劑盒和流式細胞儀測定細胞凋亡率；倒置顯微鏡觀察細胞形態；硝酸還原法檢測SH-SY5Y細胞一氧化氮（NO）的含量。結果 與對照組比較，模型組SH-SY5Y細胞存活率降低、細胞凋亡率增加和NO含量升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細胞存活率增加、細胞凋亡率降低，NO含量降低（P<0.05）。結論 銀杏葉提取物EGb761可以通過抑制細胞內NO自由基的含量對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷起到保護作用。

關鍵詞：銀杏葉提取物EGb761；SH-SY5Y細胞；帕金森病；一氧化氮自由基

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.018

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0070-04

Effects of Extract of Ginkgo biloba Leaves EGb761 on MPP+-induced Injury in SH-SY5Y Cells XUE Li-hua， WU Xing-bin， LIAN Fo-yan， PAN Jian （Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of extract of Ginkgo biloba leaves EGb761 on 1-methy-l 4-phenylpyridium （MPP+）-induced injury in human neuroblastoma SH-SY5Y cells； To discuss its mechanism of action. Methods Cell culture method was used and SH-SY5Y cell damage model was induced with different concentrations of MPP+ to build Parkinsons disease model in vitro. The experiment was divided into control group， MPP+ model group， low-， medium-， and high-dose EGb761 groups. The survival rate was determined by MTT assay， and the apoptotic rate was detected by flow cytometry according to AnnexinV apoptosis detection kit. The cell morphology was observed by inverted microscope. NO content in SH-SY5Y cells was detected by Nitric acid reduction method. Results Compared with the control group， the survival rate of SH-SY5Y cells decreased and the apoptotic rate and NO content increased in the model group （P<0.05）； Compared with the model group， the survival rate of SH-SY5Y cells increased and the apoptotic rate and NO content decreased in the low-， medium- and high-dose EGb761 groups （P<0.05）. Conclusion EGb761 can protect MPP+-induced SH-SY5Y cell from damage by the inhibition of the content of NO free radical.

Key words： extract of Ginkgo biloba leaves EGb761； SH-SY5Y cell； Parkinsons disease； NO free radical

帕金森病（Parkinsons disease，PD）是一種表現為功能性障礙的神經退行性疾病。臨床上主要有靜止性震顫?肌肉僵直和運動遲緩等表現癥狀。PD是由多巴胺能神經元死亡引起的，其機制在于黑質多巴胺能神經元變性中存在的細胞凋亡現象[1]。隨著人口老齡

基金項目：甘肅省科技計劃項目（145RJZA143）

通訊作者：潘劍，E-mail：ldeypj@163.com

化的速度加快，PD等神經退行性疾病在老年人中的發病率逐漸升高。據研究顯示，全球每年大約有400萬新增患者[2]。PD治療仍缺乏有效的藥物，目前臨床治療PD的藥物主要為膽堿脂酶抑制劑和NMDA受體拮抗劑，該類藥物雖能改善PD患者的認知和記憶功能，但無法有效地控制PD患者的病理進展。因此，尋找一種能夠延緩或逆轉PD的病理進展的藥物，仍然是當前PD研究的難點。近年來，隨著國內外學者對PD機制研究的不斷深入，發現中藥具有延緩PD進展的作用[3-4]。由于中醫藥在防治PD等老年性疾病方面有豐富的實踐經驗且毒性相對較小，逐漸受到研究者們的關注。研究顯示，銀杏葉提取物具有抑制細胞凋亡和保護神經細胞損傷等生理作用[5]。本實驗采用細胞培養方法，建立SH-SY5Y細胞1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）損傷PD體外模型，觀察銀杏葉提取物EGb761對SH-SY5Y細胞損傷的影響，探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株

SH-SY5Y細胞株，中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物

EGb761（含24%黃酮糖苷和6%銀杏苦內酯-白果內酯的銀杏葉提取物），40 mg/粒，法國博福-益普生制藥工業公司，批號H03736。

1.3 主要試劑與儀器

胰蛋白酶，南京森貝伽生物科技有限公司； MPP+、MTT、DMEM培養基，胎牛血清（FBS），Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）?雙抗（青?鏈霉素），南京維森特生物技術有限公司；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，北京寶賽生物技術有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒，上海谷研實業有限公司。Diaphot倒置顯微鏡、高速離心機（德國Hettich公司），流式細胞儀（FACSCalibuar，BD），CO2培養箱（美國Shellab公司），超凈工作臺（新加坡ESCO公司）。

1.4 SH-SY5Y細胞培養

將SH-SY5Y細胞接種于培養瓶中，細胞密度為1.2×104個/cm2。采用DMEM培養基（10%FBS，青霉素100 U/mL和鏈霉素100 U/mL），置于37 ℃?5% CO2細胞培養箱中連續培養。

1.5 分組、造模及給藥

采用MPP+誘導細胞建立SH-SY5Y神經細胞損傷模型。實驗分為對照組、模型組和中藥低、中、高劑量組。對照組為無血清DMEM培養基（不含10%FBS），模型組為含有1 mmol /L MPP+的無血清培養基，中藥低、中、高劑量組分別含有2.5、5、10 g/L EGb761及10%FBS的DMEM培養基。

1.6 MTT法檢測細胞存活率

用0.25%胰酶將細胞稀釋為5×106個/mL的細胞懸浮液，接種于96孔板中，每孔加200 μL懸液，置于培養箱中培養。細胞貼壁后，置于培養箱中常規培養。每組設4個復孔，實驗重復4次。培養48 h后棄去培養基，每孔加20 μL濃度為0.5 g/L的MTT，繼續孵育4 h。棄去培養基，加200 μL DMSO，震蕩1 min，于酶標儀波長570 nm處檢測各孔吸光度（OD）值，取其平均值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）=實驗組OD值÷對照組OD值×100%。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率

用PBS清洗細胞2次，用不含EDTA 0.25%胰酶消化SH-SY5Y細胞，收集對數期生長期細胞。用PBS洗滌細胞2次，2000 r/min離心3 min，調整細胞密度為3×104個/mL。各組細胞孵育24 h后，加入500 μL Binding Buffer?5 μL AnnexinV-FITC及5 μL碘化丙啶混勻，室溫避光反應10 min，于室溫下避光反應10 min，進行觀察和檢測分析。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數÷（凋亡細胞數+正常細胞數）×100%。

1.8 硝酸還原法測定一氧化氮含量

分別取形態學觀察實驗中5個實驗組的細胞，反復凍融3次使細胞破裂，收集培養液100 μL，按試劑盒說明書進行操作，分別測得各組OD值，計算NO含量?

1.9 細胞形態學觀察

取對數生長期的細胞，用0.25%胰酶調整細胞濃度為3×104個/mL的細胞懸浮液，接種于96孔板中，置于培養箱中常規培養?細胞貼壁后，繼續培養48 h，置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.10 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗?P<0.05表示差異有統計學意義?

2 結果

2.1 EGb761對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響

與對照組比較，模型組SH-SY5Y細胞存活率下降（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細胞存活率升高（P<0.05）。結果見表1。

2.2 EGb761對MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

與對照組比較，模型組SH-SY5Y細胞凋亡率升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細胞凋亡率降低（P<0.05）。結果見表2。

2.3 EGb761對MPP+誘導SH-SY5Y細胞一氧化氮含量的影響

與對照組比較，模型組SH-SY5Y細胞NO含量升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組SH-SY5Y細胞NO含量降低（P<0.05）。結果見表3。

2.4 EGb761對MPP+誘導SH-SY5Y細胞形態的影響

對照組SH-SY5Y細胞多呈梭形或橢圓形，細胞表面有少量細長突起，細胞狀態增殖良好；模型組SH-SY5Y細胞皺縮成圓形或橢圓形，邊界模糊，細胞形態差異較大，有較明顯的凋亡特征；中藥各劑量組細胞亦有少數細胞凋亡的現象發生，但是明顯少于模型組，細胞皺縮現象減少，細胞數量較模型組明顯增多，細胞生長較均勻，外形規則，正常突起較多。結果見圖1。

3 討論

人神經瘤母細胞SH-SY5Y衍生于人的神經母細胞瘤細胞系SK-N-SH，是一種重要的具有多巴胺能特性的神經瘤細胞，是研究神經元凋亡的最常用細胞模型。MPP+可選擇性誘導黑質多巴胺神經元缺失，通過使線粒體能量缺失，降低細胞膜電位、損傷線粒體呼吸鏈，從而導致過氧化產物和自由基增加，引起細胞的凋亡[6-7]，是公認的能誘導神經元凋亡的細胞毒素。實驗常用MPP+誘導的SH-SY5Y細胞來模擬PD體外模型[8-9]?因此，本實驗采用MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡作為PD體外模型?

銀杏葉提取物EGb761含有多種活性成分，如黃酮類?萜內酯類?酚酸類化合物等。黃酮類與糖苷結合具有清除氧自由基，對抗興奮性神經遞質的釋放、拮抗血小板活化因子等藥理活性[10-11]，并能降低MPP+誘導的細胞毒性，起到保護神經細胞的作用[12-13]。

本實驗結果顯示，1 mmol/L MPP+使SH-SY5Y細胞存活率下降至43.66%，5、10 g/L EGb761均能提高SH-SY5Y細胞存活率。2.5、5、10 g/L EGb761分別與MPP+同時處理細胞后，細胞凋亡率由模型組的89.32%分別降至73.61%、33.68%、15.76%。

細胞凋亡是在病理和生理條件下細胞的一種主動死亡過程，主要包括細胞皺縮變圓，與相鄰細胞分離，細胞漿和染色質濃縮，導致細胞膜內陷，細胞分離成多個凋亡小體。近年來，隨著人們對于細胞凋亡機制的不斷深入研究，發現有很多物質諸如小分子化合物NO參與了凋亡的過程。NO是一種自由基，也是體內重要的信使分子，可以通過多種途徑影響細胞的凋亡。細胞在病理狀態下，一氧化氮合酶得到活化，產生大量的NO，NO通過誘導針對腫瘤細胞及周圍細胞的細胞毒效應促進細胞凋亡。NO發揮促進凋亡的機制可能為：①NO通過細胞內的氧化還原電位，促進細胞色素C的釋放，活化細胞凋亡信號通路。②通過抗氧自由基活性，減少脂質過氧化產物的生成，從而保護細胞膜的完整性。③保護線粒體結構功能的完整性，防止細胞凋亡的發生?本實驗結果顯示，細胞經1 mmol /L MPP+處理后NO含量升高，當加入不同劑量EGb761后，SH-SY5Y細胞NO含量降低。本研究使用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態，對照組細胞生長狀態良好，模型組細胞顯示出明顯的凋亡特征，實驗組經不同濃度EGb761處理后，中藥各劑量組細胞亦有細胞凋亡的現象發生，但是明顯少于模型組。

綜上所述，EGb761能夠顯著降低MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，從而起到保護細胞損傷的作用，推測其機制可能與抑制細胞內NO自由基的含量有關。

參考文獻：

[1] CAMPDELACREU J. Parkinson disease and Alzheimer disease：environmental risk factors[J]. Neurologia，2012，29（9）：541-549.

[2] BETARBET R， SHERER T B， MACKENZIE G， et al. Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson's disease[J]. Nat Neurosci，2000，3（12）：1301-1306.

[3] 楊旭芳，趙永光，楊云芳.銀杏葉提取物對糖尿病大鼠腦組織的保護作用[J].中國老年學雜志，2010，30（11）：1554-1556.

[4] TALIYAN R， SHARMA P L. Protective effect and potential mechanism of Ginkgo biloba extract EGb 761 on STZ-induced neuropathic pain in rats[J]. Phytother Res，2012，26（12）：1823-1829.

[5] VITOLO O， GONG B， CAO Z， et a1. Protection against beta-amyloid induced abnormal synaptic function and cell death by Ginkgolide[J]. Neurobiol Aging，2009，30（2）：257-265.

[6] SUN F L， ZHANG L， ZHANG R Y， et a1. Tetrahydroxystilbene glucoside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against MPP+-induced cytotoxicity[J]. Eur J Pharmacol，2011，660（2/3）：283-290.

[7] ARDUTNO D M， ESTEVES A R， CARDOSO S M， et a1. Endoplasmic reticulum and mitochondria interplay mediates apoptotic cell death：relevance to Parkinson's disease[J]. Neurochem Int，2009， 55（5）：341-348

[8] LI D， LIU Q， JIA D， et al. Protective effect of arctigenin against MPP+ and MPTP-induced neurotoxicity[J]. Planta Med，2014，80（1）：48-55.

[9] KIM S Y， KIM MY， MO J S， et al. SAG protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against MPP+ induced cytotoxicity via the downregulation of ROS generation and JNK signaling[J]. Neuroscience Letters，2007，413（2）：132-136.

[10] YASUI FUMKORI N， FURUKORI H， KANEDA A. The effects of Ginkgobiloba extracts on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of donepezil[J]. J Clin Pharmacol，2004，44（5）：538-542.

[11] 官堂明，黃家園，黃潔浩，等.銀杏葉提取物防治神經系統疾病的臨床研究進展[J].中國老年學雜志，2012，32（22）：5078-5081.

[12] ARMINDER S S， RAJEEV T， PYARE L S. Protective effect and mechanism of Ginkgo biloba extract-EGb 761 on STZ-induced diabetic cardiomyopathy in rats[J]. Pharmacogn Mag，2014，10（38）：172-178.

[13] OBULESU M， DOWLATHABPD M R. Effect of plant extracts on Alzheimer's disease：an insight into therapeutic avenues[J]. Journal of Neurosciences in Rural Practice，2011，2（1）：56-61.

（收稿日期：2015-07-26）

（修回日期：2015-08-22；編輯：華強）