大桑菊合劑對小鼠遲發型變態反應性肝損傷的影響

徐嘉輝 黃雪君 曾巧煌 藍燕嬌 張曉露 余德釗

摘要：目的 觀察大桑菊合劑對小鼠遲發型變態反應性肝損傷的影響，探討其抗炎免疫的作用機制。方法 采用腹腔注射環磷酰胺處理后，予2，4，6-三硝基氯苯2次外涂腹部皮膚致敏，再經皮肝穿刺攻擊造模。實驗小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥高、中、低劑量組。中藥高、中、低劑量組給予大桑菊合劑灌胃，每日1次，連續7 d。ELISA檢測小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平，HE染色觀察肝臟組織病理形態。結果 與正常組比較，模型組AST、ALT和TNF-α水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組ALT、AST和TNF-α水平顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；中藥各劑量組較模型組均能減輕肝組織局部炎癥浸潤與水腫。結論 大桑菊合劑對小鼠遲發型變態反應性肝損傷具有保護作用。

關鍵詞：大桑菊合劑；遲發型變態反應；肝損傷；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.019

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0074-03

Protective Effects of Dasangju Mixture on Liver Injury Induced by Delayed-type Hypersensitivity in Mice XU Jia-hui1， 2， HUANG Xue-jun1， ZENG Qiao-huang1， LAN Yan-jiao1， ZHANG Xiao-lu1， YU De-zhao2 （1. The Second Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China； 2. Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective To investigate the protective effects of Dasangju Mixture on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice； To discuss its mechanism of anti-inflammatory-immunity. Methods After enterocoelia intravenous injection of cyclophosphamide was used， 2，4，6-picryl chloride was used twice for exterior coating for skin of abdomen to cause sensation of skin. Then percutaneous transhepatic puncture was used to attack for modeling. Male Kunming mice were randomly divided into blank group， model group， high-， medium- and low-dose treatment groups. The high-， medium- and low-dose treatment groups were given Dasangju Mixture for gavage， once a day for 7 days. ELISA was applied to determine the serum levels of aspartate aminotransferase （AST）， alamine aminotransferase （ALT） and tumor necrosis factor （TNF）-α. Pathological features of liver tissue were observed by HE staining. Results Compared with the blank group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the model group increased significantly （P<0.05）； Compared with the model group， the levels of AST， ALT and TNF-α in the high-， medium- and low-dose treatment groups decreased significantly （P<0.05， P<0.01， P<0.001）； Compared with the model group， high-， medium- and low-dose treatment groups can better alleviate topical inflammation infiltration and edema of liver tissue. Conclusion Dasangju Mixture has certain protective effects on the liver injury induced by delayed-type hypersensitivity in mice.

Key words： Dasangju Mixture； delayed-type hypersensitivity； liver injury； mice

藥物性肝損害是兒童常見的藥物不良反應之一，世界衛生組織個例安全性病例報告數據庫中報道，兒童藥物肝損害占其他類型的損害1%，常見藥物有撲

基金項目：廣東省自然科學基金（2014A030313646）；廣東省中醫藥局科技項目（20120108）

通訊作者：余德釗，E-mail：928279647@qq.com

熱息痛、紅霉素等[1]。肺炎支原體肺炎是兒童社區獲得性肺炎常見病之一，其首選藥物是大環內酯類藥物，如阿奇霉素等[2]。然而，研究表明阿奇霉素序貫治療小兒肺炎支原體肺炎與藥物性肝炎有一定相關性，年齡越小相關性越大[3]。大桑菊合劑是我們的臨床驗方，其聯合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎能夠明顯縮短療程，降低胃腸道及肝損害等不良反應發生率，且能雙向調控促炎因子白細胞介素（IL）-6與抑炎因子IL-10，其作用機制與免疫調控相關[4]。為此，我們通過大桑菊合劑對遲發型變態反應（DTH）性肝損傷動物模型丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的作用，觀察大桑菊合劑對小鼠DTH性肝損傷的影響，探討其抗炎免疫的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性昆明種小鼠50只，6～8周齡，體質量16～18 g，廣州中醫藥大學動物實驗中心，許可證號SCXK（粵）2013-0034。飼養于（22±2）℃相對恒溫環境，濕度60%～80%，自由飲食。

1.2 藥物

大桑菊合劑（桑葉3 g，菊花3 g，浙貝母2 g，甘草1 g，黃芩3 g，薄荷 1g，魚腥草2 g，連翹2 g，青天葵1 g，蘆根2 g，桔梗2 g），廣州市康源藥業有限公司，10 mL/支，批號20141001。

1.3 主要試劑與儀器

2，4，6-三硝基氯苯（PCl，深圳伽馬生物有限公司），環磷酰胺（Sigma公司），AST、ALT、TNF-α小鼠ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）。RAD680酶標儀（美國伯樂），BX51型顯微鏡（日本奧林巴斯），冷凍高速離心機（Sigma公司）。

1.4 造模

刮去小鼠腹毛，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉；經腹腔注射予200 mg/kg環磷酰胺致小鼠免疫抑制。1 d后予1%PCl的乙醇溶液100 μL腹部暴露皮膚致敏，5 d后再次同樣致敏，再5 d后，用0.2%PCl的橄欖油溶液10 μL肝內注射，造成PCl-DTH模型。

1.5 分組、給藥及處理

實驗小鼠隨機分為空白組、模型組和中藥低、中、高劑量組，每組10只。劑量采取體表面積法估算，中藥低、中、高劑量組給予相應劑量大桑菊合劑灌胃，均定容至0.6 mL，高劑量（8.60 g/kg）相當于18歲以上劑量，中劑量（4.30 g/kg）相當于3～18歲劑量，低劑量（2.10 g/kg）相當于3歲以下劑量；模型組與空白組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，連續7 d。末次給藥18 h后進行常規麻醉及腹腔采血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，取血清后備測。脫頸處死小鼠，取左葉局部病變組織，10%福爾馬林液固定備用。

1.6 小鼠肝組織病理形態學觀察

取約2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm肝臟局部病變組織進行常規脫水、石蠟包埋，制成切片。HE染色鏡下觀察肝臟組織形態學變化。參照文獻[5]對肝組織病理形態改變進行評價。按病變程度進行計分：0分，輕微改變；1分，輕中度改變；2分，中度改變；3分，中重度改變；4分，重度改變。

1.7 指標檢測

于酶標儀波長450 nm處，ELISA測定ALT、AST，于酶標儀波長490 nm處，ELISA測定TNF-α，均嚴格按照試劑盒說明操作。

1.8 統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用t檢驗或秩和檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大桑菊合劑對小鼠肝組織病理形態的影響

正常組小鼠肝小葉結構清楚，肝細胞索排列整齊，肝細胞輕微水腫，核結構清晰，肝竇正常；模型組小鼠肝細胞彌漫性水腫，胞漿疏松化，胞質色淡，肝細胞點狀壞死，散在有炎性細胞浸潤；大桑菊合劑高、中、低劑量組均較模型組小鼠肝臟狀況明顯改善。結果見圖1、表1。

2.2 大桑菊合劑對模型小鼠血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清AST、ALT水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠血清AST、ALT水平顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結果見表2。

2.3 大桑菊合劑對模型小鼠血清腫瘤壞死因子-α水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組小鼠血清TNF-α含量顯著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結果見表3。

正常組 模型組 中藥低劑量組

中藥中劑量組 中藥高劑量組

圖1 各組小鼠肝組織病理形態（HE染色，×200）

3 討論

PCl-DTH小鼠動物模型是由活化的CD4+T細胞介導實驗性肝損傷模型[6]。同時，相關細胞因子如IL、TNF-α起重要的調節作用；其中，TNF-α劑量依賴性地促進抗原攻擊18 h后T細胞的黏附能力，并且這種促進作用明顯高于對脾總淋巴細胞的作用；T細胞與細胞外基質間的黏附能力受細胞因子的調節而上升可能是DTH初期的細胞病理學特征之一。

實驗結果表明，大桑菊合劑能明顯改善肝細胞局部炎癥浸潤水腫，既可以顯著降低血清ALT、AST水平，又能減少Th1型細胞因子TNF-α含量，提示其可能對Th1細胞介導的DTH初期具有調節的作用。

大桑菊合劑由桑葉、菊花、浙貝母、甘草、黃芩、薄荷、魚腥草、連翹、青天葵、蘆根、桔梗等中藥經乙醇提取制成，為古方桑菊飲加減而得，長期運用于治療兒童呼吸道疾病。方中黃芩有效成分黃芩苷具有抗炎抑菌、抗病毒、清除自由基以及抗腫瘤等作用，且能對肝臟和免疫系統起到保護作用[7]；連翹有效成分連翹苷元對四氯化碳誘導大鼠急性肝損傷具有保護作用，能夠明顯降低血清TNF-α、IL-8水平[8]。另外，我們前期研究表明，大桑菊合劑具有明顯的抗炎抑菌作用，聯合阿奇霉素治療肺炎支原體具有顯著療效；同時能夠明顯降低Th2細胞因子IL-6與IL-10的血清濃度水平[4]。另有研究表明，IL-6在變態反應性肝損傷初期作用并不明顯；TNF-α可誘導IL-6的合成，IL-6則抑制TNF-α的產生，兩者是肝臟再生的早期信號[9]。

由此可見，大桑菊合劑不僅具有護肝的作用，其還能通過動態調節Th1/Th2平衡漂移機制起到抗炎免疫的作用。其在肺炎支原體肺炎治療中，初期通過平衡Th1細胞因子水平，既能減輕肝損傷，又能起到抗炎的效果；后期通過平衡Th2細胞因子水平，使Th1/Th2趨于穩定，從而達到提高聯合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎的作用，但其具體信號通路仍待進一步探討。

參考文獻：

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（收稿日期：2015-10-30）

（修回日期：2015-11-27；編輯：華強）