3種含重金屬制劑的微生物限度檢查方法的驗證

管敏 周琴妹

摘要：目的 建立定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏3種含重金屬制劑的微生物限度檢查方法。方法 按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）的規定測定3種制劑對細菌、真菌和酵母菌的回收率，并對其控制菌檢查方法進行驗證。結果 定癇丸采用培養基稀釋法、皮脂搽劑采用預濾過和培養基稀釋法聯用、加味黃芩油膏采用萃取法處理樣品，5株菌回收率均可達70%以上，控制菌檢查也分別采用相應的方法。結論 本研究建立了定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏3種不同劑型含重金屬制劑的微生物限度檢查方法。

關鍵詞：培養基稀釋法；萃取法；重金屬；微生物限度

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.026

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0101-03

Verification of Microbial Limit Test Methods for Three Kinds of Preparations with Heavy Metals GUAN Min， ZHOU Qin-mei （Pharmacy Department of Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

Abstract： Objective To establish the methods of microbial limit test for three kinds of preparations with heavy metals， such as Dingxian Pills， Pizhi Lotion and Jiawei Huangqin Ointment. Methods According to Chinese Pharmacopoeia 2010， the recovery rates of bacteria， fungus and yeast treated by three preparations were detected. And the methods of testing control bacteria were also validated. Results Culture medium dilution method was proved to be applicable for Dingxian Pills. Culture medium dilution method combined with pre-filtration method was proper for Pizhi Lotion. And the extraction method was adopted for Jiawei Huangqin Ointment. The recovery rates of these five validation strains reached 70% by appropriate methods. And the same methods were used for validation of the control bacteria. Conclusion The methods of microbial limit test for these three different preparations were established through this study.

Key words： culture medium dilution method； extraction method； heavy metals； microbial limit test

定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏均為本院制劑，臨床使用多年。定癇丸為口服丸劑，用于痰迷驚厥、牙關緊閉、抽搐痙攣等癲癇病癥。皮脂搽劑和加味黃芩油膏分別為外用酊劑和油膏劑，具有解毒、止癢等功效。該3種制劑為不同劑型，且都含有重金屬成分，已知重金屬砷、汞等對微生物的生長有抑制作用[1-2]，本研究按照2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）[3]的要求，采用合適的樣品處理方法，如培養基稀釋法、預濾過法、萃取法或幾種方法聯用，消除3種制劑的抑菌作用后再進行檢驗，以期獲得更可靠、更準確的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

YX-280 D-TT手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰

基金項目：江蘇省中醫院科研項目（Y13043）

通訊作者：周琴妹，E-mail：zhoumeizi0917@163.com

醫療設備有限公司），DNP-9082電熱恒溫培養箱（上海申賢儀器設備廠），MJ-100B霉菌培養箱（上海浦東榮豐科學儀器有限公司），100級潔凈工作臺（AIR TECH，蘇州安泰空氣技術有限公司），DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽（上海一恒科技有限公司），滅菌移液管（1、5、10 mL）及無菌培養皿（90 mm）。

供試品定癇丸（由朱砂、青果、貝母等組成，批號1501001、1503002、1505003）、皮脂搽劑（由硫磺、白礬、輕粉組成，批號1505005、1505006、1507007）和加味黃芩油膏（由輕粉、石膏、冰片、枯礬、黃芩等組成，批號1412005、1503001、1507003）均由本院制劑部生產。

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44 102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B） 63 501]、白色念珠菌[CMCC（F）98 001]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]、黑曲霉[CMCC（F）98 003]，均由江蘇省藥檢所提供，傳代次數均為第4代。

營養瓊脂培養基（批號131224）、營養肉湯培養基（批號070313）、改良馬丁培養基（批號1110203）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號1401132）、膽鹽乳糖培養基（批號1401072）、改良馬丁瓊脂培養基（批號050407）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG，批號101020）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號100128）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號150513），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號1306192），均購自北京三藥科技開發公司。0.9%無菌氯化鈉溶液（本實驗室配制）。

2 方法

2.1 供試液的制備

2.1.1 定癇丸 稱取本品10 g，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中至100 mL，振蕩箱中45 ℃振搖30 min，倒入研缽中研磨均勻，作為1∶10供試液。

2.1.2 皮脂搽劑 本品振搖均勻，量取10 mL，加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中至100 mL，振搖均勻，作為1∶10供試液，采用脫脂棉對供試液進行預過濾[3]，去除沉淀，濾液備用。

2.1.3 加味黃芩油膏 稱取樣品10 g于無菌研缽中，加入無菌十四烷酸異丙酯20 mL，研磨均勻，轉移至分液漏斗中，加入45 ℃、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，振搖5 min，靜置，使油水分層，取水層，作為1∶10的供試液[4]。

2.2 菌液制備

大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌新鮮培養物接種至營養肉湯培養基中，于35 ℃培養24 h；白色念珠菌新鮮培養物接種至改良馬丁培養基中，于28 ℃培養24 h。上述培養物用0.9%無菌氯化溶液10倍稀釋至相應濃度，制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液。黑曲霉新鮮培養物接種至改良馬丁瓊脂培養基中，培養5 d，加入0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為50～100 cfu的孢子懸液。

2.3 細菌、霉菌及酵母菌計數

2.3.1 菌落培養及計數 ①常規方法：取供試液1 mL及試驗用菌的各種菌液1 mL，立即傾注15～20 mL溫度不超過45 ℃營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混勻，凝固，于相應溫度條件下倒置培養，計數。②培養基稀釋法：取供試液1 mL平均加至多個平皿中，加入試驗用菌的各種菌液1 mL，培養并計數。試驗組加供試液及各試驗菌液，菌液組不加供試液，供試品對照組不加菌液，稀釋劑對照組用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，其余操作方法相同。

2.3.2 回收率計算 以上試驗重復3次，分別計算5種試驗菌株的回收率。稀釋劑對照組回收率（%）=稀釋劑對照組平均菌落數÷菌液組平均菌落數×100%。試驗組回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）÷菌液組平均菌落數×100%。

2.4 控制菌檢查

2.4.1 大腸埃希菌 ①試驗組：取定癇丸1∶10供試液10 mL及1 mL大腸埃希菌（含菌數為10～100 cfu），加入200 mL膽鹽乳糖培養基中，經35～37 ℃培養24 h后，再進行MUG試驗和靛基質試驗。②空白對照組：取1∶10供試液10 mL，加入200 mL膽鹽乳糖培養基中，經35～37 ℃培養24 h后，再進行MUG試驗和靛基質試驗。③陰性組：1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數為10～100 cfu），加入200 mL膽鹽乳糖培養基中，經35～37 ℃培養48 h后，再進行MUG試驗和靛基質試驗。

2.4.2 金黃色葡萄球菌 ①試驗組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL及1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數為10～100 cfu），加入適量營養肉湯培養基中，經35～37 ℃培養24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養24 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。②空白對照組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL，加入適量營養肉湯培養基中，經35～37 ℃培養24 h后，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養24 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。③陰性組：1 mL大腸埃希菌（含菌數為10～100 cfu），加入適量營養肉湯培養基中，經35～37 ℃培養24 h，再用甘露醇氯化鈉瓊脂平板分離培養24 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

2.4.3 銅綠假單胞菌 ①試驗組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL及1 mL銅綠假單胞菌液（含菌數為10～100 cfu），加入適量膽鹽乳糖培養基中，振搖均勻，經35～37 ℃培養24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養48 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。②空白對照組：取皮脂搽劑和加味黃芩油膏供試液各10 mL，加入適量膽鹽乳糖培養基中，振搖均勻，經35～37 ℃培養24 h后，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養48 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。③陰性組：1 mL金黃色葡萄球菌（含菌數為10～100 cfu），加入適量營養肉湯培養基中，經35～37 ℃培養24 h，再用溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板分離培養48 h，觀察有無菌落及菌落形態，判斷結果。

3 結果

3.1 細菌、霉菌及酵母菌計數驗證

定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏采用常規方法驗證的回收率不滿足要求。①定癇丸采用培養基稀釋法驗證（0.5 mL/皿），其抑菌作用基本被消除，5種菌回收率均>70%，可采用培養基稀釋法檢查細菌、真菌及酵母菌計數。②皮脂搽劑的溶劑為60%乙醇，其中有白礬、輕粉為不溶性沉淀，配成1∶10供試液之后，硫磺不溶于水也析出，前期試驗發現這些沉淀具有較強抑菌作用，故先采用脫脂棉對供試液進行預過濾[3]，去除沉淀，濾液再采用培養基稀釋法驗證，稀釋劑對照組和5種試驗菌的回收率均>70%。③加味黃芩油膏中含黃芩、黃柏、枯礬、輕粉等，具有較強的抑菌活性，因其基質為凡士林，采用乳化劑研磨均勻后也不能通過濾膜，無法采用薄膜過濾法消除其抑菌活性，故將加味黃芩油膏用十四烷酸異丙酯溶解，采用萃取法處理樣品，并聯合使用培養基稀釋法，稀釋劑對照組回收率>70%，5株試驗菌的回收率>70%。結果見表1。

3.2 控制菌驗證

定癇丸采用培養基稀釋法檢查大腸埃希菌，結果見表2。皮脂搽劑和加味黃芩油膏按“2.1”項下方法處理，采用培養基稀釋法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，試驗組均可檢出，陰性組和空白對照組未檢出，滿足要求，結果見表3。

4 討論

定癇丸加稀釋劑后振搖30 min（45 ℃、150 r/min），充分崩解，研磨后能分散均勻。制丸之后采用朱砂包衣，其中硫化汞含量較低，采用培養基稀釋法（0.5 mL/皿）即可消除其抑菌作用，5種菌回收率均>70%。

皮脂搽劑為含有硫磺、白礬、輕粉的混懸液，溶劑為60%（V/V）的乙醇，制成1∶10供試液后，溶劑性質改變，硫磺不溶于水而析出，這些沉淀一方面有較強抑菌作用，另一方面也影響平皿中菌落的計數。采用500 r/min低速離心5 min，仍有一部分沉淀浮于液面，故考慮用預過濾法進行粗濾去除沉淀。據文獻報道，用濾紙過濾，過濾后菌液濃度降低70%～80%，影響樣品中微生物的檢出；用無菌脫脂紗布和脫脂棉過濾，過濾前后菌液的濃度基本保持一致，但紗布對微小懸浮物的濾除作用差[4]。故本試驗采用脫脂棉進行預過濾，而后濾液用培養基稀釋法進行檢查，回收率能夠達到70%以上。

加味黃芩油膏以凡士林為基質，含輕粉、石膏、冰片、枯礬及黃芩提取液等，具有較強的抑菌活性。曾采用中和法和培養基稀釋法，均不能完全消除抑菌活性。這類以凡士林、羊毛脂等為基質的軟膏劑應盡量避免使用薄膜過濾法，因為油脂性基質過膜困難，很容易堵塞濾膜。故采用十四烷酸異丙酯溶解樣品，pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液萃取出樣品中的微生物，作為供試液，再聯合培養基稀釋法，可消除加味黃芩油膏的抑菌活性，5株菌的回收率滿足要求。

含重金屬制劑的微生物限度檢查，可優先選擇中和法或培養基稀釋法，重金屬含量高或還有其他抑菌成分的制劑可聯合使用培養基稀釋法、薄膜過濾法、萃取法等。定癇丸、皮脂搽劑和加味黃芩油膏分別為丸劑、搽劑和軟膏劑，本研究選取這3種具有代表性的制劑進行研究，為含有重金屬、具有抑菌活性制劑的微生物限度檢查方法的選擇提供了參考依據。

參考文獻：

[1] 徐韜，徐先祥，林小鳳，等.朱砂與石膏體外抑菌作用研究[J].中國民族民間醫藥，2011，20（23）：57-58.

[2] 陸繼梅，孟建華，安立，等.紅粉、輕粉體外抗菌作用實驗研究[J].新中醫，2012，44（7）：157-158.

[3] 苑思坤，李玉芝，王紅云.微生物限度檢查薄膜過濾法供試液預處理方法探討[J].中國藥業，2010，19（18）：42-43.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

（收稿日期：2015-08-13）

（修回日期：2015-09-01；編輯：陳靜）