17β雌二醇對人皮膚成纖維細胞膠原和彈性蛋白合成的影響

孟飛　王麗　王彥　郗林鶴　張潔

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17β雌二醇對人皮膚成纖維細胞膠原和彈性蛋白合成的影響

孟飛王麗王彥郗林鶴張潔

【摘要】目的探討不同濃度17β雌二醇（17β-estrogen，17β-E2）在不同時間點對體外培養的人皮膚成纖維細胞（Human skin fibroblast，hSFB）合成膠原及彈性蛋白的影響。方法體外培養hSFB，分別加入不同濃度的17β-E2（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），繼續培養24 h、48 h、72 h，在不同時間點分別提取相應的RNA，RT-PCR檢測經17β-E2處理后的hSFB的Ⅰ、Ⅲ型前膠原及原彈性蛋白mRNA的表達情況。結果RT-PCR結果顯示，17β-E2處理組較空白對照組前膠原及原彈性蛋白表達水平在24 h沒有變化，48 h時明顯上調，72 h時呈現下降；在48 h時，17β-E2對前膠原與原彈性蛋白的影響，10-10mol/L組上調作用較其他濃度組明顯；在48 h時，同一濃度17β-E2對前膠原蛋白的促進作用較原彈性蛋白明顯，尤其是對Ⅲ型的促進作用更強。結論17β-E2對膠原及彈性蛋白的合成有一定的促進作用，不同時間、不同濃度對其影響不同，在10-10mol/l、48 h時作用最強。

【關鍵詞】17β雌二醇人皮膚成纖維細胞膠原蛋白彈性蛋白

作者單位：261000山東省濰坊市濰坊醫學院（孟飛）；250014山東省濟南市山東大學附屬千佛山醫院（孟飛，王彥，郗林鶴，張潔）；261000山東省濰坊市濰坊醫學院附屬醫院生殖中心（王麗）。

絕經期后女性皮膚易變薄、彈性變差，皮膚中膠原及彈性蛋白流失增加，這與Ⅰ、Ⅲ型膠原比例倒置有關，是由于體內雌激素水平下降引起。臨床上采用雌激素替代治療（Hormone replacement therapy，HRT）后，發現患者皮膚狀態明顯改善，皮膚增厚、彈力增加，膠原量及彈性蛋白合成增加。而分泌膠原、彈性蛋白的是真皮中的成纖維細胞，因此，我們體外培養hSFB，研究不同濃度17β雌二醇（17β-E2）對合成膠原及彈性蛋白的影響，以提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源

標本取自行上瞼皮膚松弛矯正手術的絕經后女性的上瞼皮膚標本。

1.1.2主要試劑和儀器

Ⅰ型膠原酶（索萊寶生物技術公司）；胰酶、胎牛血清、DMEM（Gibco公司）、17β雌二醇粉劑（Sigma公司）；RNA提取試劑盒（康為試劑生物有限公司）；反轉錄試劑、SYBR Green（臺灣東洋紡股份有限公司）。熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。1.2方法

1.2.1hSFB的分離與培養

皮膚標本用含雙抗的Hanks液徹底洗凈，分離并剪碎真皮組織，用含1%的Ⅰ型膠原酶DMEM液37℃、5%CO2孵育箱消化4～6 h，200鉬篩網過濾收集細胞，離心，含15%FBS的DMEM液重懸細胞，接種于25 cm培養瓶；以1∶3比例傳代培養。

1.2.2細胞種板與藥物處理

第4代細胞接種于6孔板，設5個雌二醇濃度組（濃度分別為：10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）和1個對照組，每個濃度設2個復孔，細胞貼壁后24 h，分別向6孔板中加入含不同濃度雌激素的15%FBS 的DMEM培養液，繼續培養24 h、48 h和72 h。

1.2.3細胞總RNA的提取及逆轉錄

待藥物作用24 h、48 h、72 h后，根據RNA提取試劑盒說明書提取細胞中的總RNA，紫外線分光光度計測定A260/A280比值及RNA濃度；將RNA反轉錄成cDNA，逆轉錄體系總體積16 μL：RT PrimerScript Buffer 4 μL，RT Enzyme 1 μL，RT Primer MIX 1 μL，無RNA酶水10 μL。RNA 4 μL 65℃變性5 min，加反應逆轉錄體系16 μL后37℃15 min，98℃5 min，所得cDNA于-80℃保存。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA水平的表達

配制反應體系，總體積10 μL：cDNA 1 μL， SYBR GREEN 5 μL，上下游引物各1 μL（表1），無菌去離子水2 μL。PCR擴增循環進行如下：95℃預變性2 min，95℃變性10 sec，60℃退火31 sec，72℃延伸30 sec，40個循環，72℃延伸3 min。每個樣品設3個復孔，同時進行目標基因和GADPH mRNA水平測定，PCR產物進行熔解曲線分析。目的基因mRNA的相對表達水平通過GAPDH mRNA水平進行確定。

1.2.5圖像分析與數據處理

用GAPDH為內參照，對Ⅰ、Ⅲ型膠原及原彈性蛋白mRNA進行定量分析，采用SPSS17.0統計軟件進行方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同時間點17β-E2的影響

前膠原與原彈性蛋白mRNA的表達情況（圖1～3）顯示，17β-E2處理組Ⅰ、Ⅲ型前膠原及原彈性蛋白的mRNA合成，24 h時17β-E2上調作用不明顯，48 h時上調作用明顯增加，72 h時對合成的促進作用較48 h下降。因此，我們推測，17β-E2可促進成纖維細胞分泌合成膠原及彈性蛋白，但作用大小可能與作用時間相關，48 h為17β-E2最佳作用時間（P＜0.05）。

2.2不同濃度17β-E2的影響

根據48 h時各組前膠原與原彈性蛋白mRNA的表達情況可以看出，一定濃度范圍內（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L），以10-10mol/L為17β-E2促進HSFB合成Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白的最有效濃度，并且濃度大小與促進合成作用不成正比（P＜0.05），而24 h、72 h時無此規律。

2.3同一濃度17β-E2對Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白合成的影響的比較

48 h時結果顯示，同一濃度17β-E2對Ⅰ、Ⅲ型前膠原和原彈性蛋白合成均有明顯的上調作用，但上調作用大小依次為III型前膠原、I型前膠原和原彈性蛋白，表明同一濃度17β-E2對Ⅲ型前膠原合成的調節最強、原彈性蛋白最弱。

表1　引物序列Table 1 Primer sequence

圖1　各組各時間點Ⅰ型前膠原mRNA的表達水平Fig. 1 The mRNA expression of procollagen Ⅰin each group at different time point

圖2　各組各時間點Ⅲ型前膠原mRNA的表達水平Fig. 2 The mRNA expression of procollagen Ⅲin each group at different time point

圖3　各組各時間點原彈性蛋白mRNA的表達水平Fig. 3 The mRNA expression of tropoelastin in each group at different time point

3　討論

女性絕經期后，皮膚衰老加快，皮膚中膠原總含量逐漸減少，特別是可溶性膠原含量下降明顯，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例逐漸倒置；彈力纖維減少退化，膠原和彈性纖維排列漸趨紊亂；皮膚含水量漸少，出現干燥、松弛、變薄、皺紋形成、色素脫失或沉著等表現［1-3］。

臨床上治療更年期綜合征常應用雌激素替代治療，在改善更年期癥狀的同時，患者的皮膚變好，皮膚厚度、彈性和保濕性均增加［4-6］，而雌二醇是進行雌激素替代治療的常用藥物。成纖維細胞是雌激素作用的靶器官之一，是真皮的主體細胞，其分泌的膠原纖維、彈性纖維及基質成分，與成纖維細胞一同構成了真皮的主體［7］。研究證明，在皺紋形成過程中，成纖維細胞是主要的效應細胞，其生物學特性的改變決定影響了皮膚老化程度［8］。因此，大量研究通過改善衰老皮膚的成纖維細胞的生物學特性，促進膠原蛋白及彈性蛋白的增加以延緩皮膚衰老。

Sator等［9］將雌二醇外用于面部6個月，發現治療組皮膚的濕度和彈力增加，皮膚的緊張性增加，皺紋變淺，且未見激素引發的不良反應。Patriarca等［10］的研究表明，經HRT治療后的絕經婦女，局部應用雌激素后面部真皮厚度及膠原數量明顯增加，而血清激素水平無明顯變化。Hosokawa等［11］應用苯甲酸雌二醇對小鼠的成纖維細胞進行培養，發現其能促進膠原合成，加速膠原成熟，抑制膠原降解。

本實驗對人皮膚成纖維細胞進行體外培養，加入不同濃度的雌二醇與空白對照組比較。有文獻報道，雌激素可促進hSFB的增殖，促增殖效應最強的有效濃度為10-10mol/L［12］，促進膠原合成的最佳濃度為10-9mol/L［13］。因此，我們設計不同濃度梯度（10-7、10-8、10-9、10-10、10-11mol/L）進行比較研究。另有文獻顯示，雌二醇對體外培養的成纖維細胞在6 h時與對照組比較，Ⅰ型前膠原mRNA的水平幾乎無改變。因此，我們適當延長了雌二醇的作用時間，設置為3個不同的時間點（24 h、48 h和72 h）［14］。實驗結果顯示，17β雌二醇對膠原和彈性蛋白有一定的促進合成作用，而且膠原的合成與雌二醇濃度不成正比，在10-10mol/L，48 h時促進作用最強。

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·論著·

Effects of 17β-estradiol on the Synthesis of Collagen and Elastin in Cultured Human Skin Fibroblasts

MENG Fei1，2，WANG Li3，WANG Yan2，XI Linhe2，ZHANG Jie2. 1 Weifang Medical University，Weifang 261000，China；2 Qianfoshan Hospital，Shandong University，Ji'nan 250014，China；3 Reproductive Center，Weifang Medical School Affiliated Hospital，Weifang 261000，China. Corresponding author: WANG Li（E-mail: wfwlstar@163.com）；WANG Yan（E-mail: wangyandr@126.com）.

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 17 beta estradiol（17β-E2）with different concentrations on the synthesis of collagen and elastin of cultured human skin fibroblasts（hSFB）at different time points in vitro. Methods Human fibroblasts were cultured with different concentrations of 17β-E2（10-7，10-8，10-9，10-10，10-11mol/L）for 24 hours，48 hours and 72 hours. The corresponding RNA was extracted at respectively time points，then mRNA expression of typeⅠprocollagen，typeⅢprocollagen and tropoelastin were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method. Results The mRNA expressions of procollagenⅠ，procollagenⅢand tropoelastin were not changed in 24 hours，but up-regulated in 48 hours and declined in 72 hours by 17β-E2 stimulations. On 48 hours，the synthesis of procollagen and tropoelastin stimulated with 10－10mol/L of 17β-E2 was significantly increased，compared with the other concentrations. On 48 hours with the same concentration，the up-regulated effect on synthesis of procollagen and tropoelastin was different，the effect on procollagen was stronger than tropoelastin，especially procollagenⅢ. Conclusion17-E2 has a certain role in promoting the synthesis of collagen and elastin，though the influence is different according to different culture time and different concentration，and the most effective concentration and culture time are 10-10mol/L and 48 hours respectively.

【Key words】17β-estrogen；Human skin fibroblast；Collagen；Elastin

【中圖分類號】R622+.l

【文獻標識碼】A

【文章編號】1673－0364（2016）02－0111－03

通訊作者：王麗（E-mail：wfwlstar@163.com）；王彥（E-mail：wangyandr@126.com）。

doi：10.3969/j.issn.1673-0364.2016.02.006

收稿日期：（2015年12月2日；修回日期：2015年12月27日）