淺談微生物實驗室中細菌的鑒定方法建立及探索

楊燕蘭 梁嘉雯

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淺談微生物實驗室中細菌的鑒定方法建立及探索

楊燕蘭 梁嘉雯

【摘要】目的 對潔凈室收集到的某一微生物進行鑒定。方法 采用無菌操作技術對所采集的環境菌進行分離培養，結合革蘭氏染色法技術及API鑒定系統，對環境菌進行鑒定分析，從而建立起微生物實驗室中細菌的鑒定方法與步驟。結果 待鑒定菌有96.1%的可能性是表皮葡萄球菌，2.1%的可能性是產色葡萄球菌。結論 該方法的鑒定概率屬于“好的鑒定”。

【關鍵詞】微生物鑒定；革蘭氏染色；API鑒定系統.

Objective To identify a microorganism collected in the clean room. Methods Using aseptic technique collected bacteria were isolated and cultured environment，combined with gram staining technology and API identification systems，forensic analysis of environmental bacteria，in order to establish microbiological laboratory methods and procedures identified in bacteria. Results The possibility that the unknown microorganism is staphylococcus epidermidis is 96.1%，the possibility that the unknown microorganism is staphylococcus chromogenes is 2.1%. Conclusion The identification probability of the method belongs to “good identification”.

【Key words】Microbial Identification，Gram staining，API identification system.

在1970年之前，世界各國的臨床微生物實驗室一直沿用100多年前由革蘭巴斯德和克霍及皮特里等人創建的傳統鑒別方法來鑒別微生物［1］。直至20世紀中葉，微生物學家才開始致力于微生物的致病力、生理及基因等方面的研究，并將數學、計算機及分子生物學技術應用于微生物分類學，從而建立了微生物數碼鑒別系統［2］。將微生物的各種生理生化特征進行分類、編號并建成編碼數據庫，再將未知微生物鑒別時所得到的生理生化特征轉換成數值，將數值與編碼數據庫對照比較，從而獲知未知微生物的鑒別方法稱為數值（或數碼）鑒別系統［3］。在眾多的細菌快速鑒定系統中，由法國生物梅里埃公司生產的API系統以其快速、簡便、準確等優點而成為目前在世界范圍內應用最廣的微生物鑒別系統［4］。該系統由試劑條、添加試劑及檢索工具等配套形成完整的微生物鑒定系統。

微生物鑒定是藥品微生物檢驗中的重要環節，《中國藥典》2015年版通則相應章節中對檢出微生物的鑒定做了明確規定［5］。對受控環境收集到的微生物進行微生物的常規特征（包括菌落形態學、細胞形態學、革蘭染色及一些關鍵生化反應）進行分析，以滿足鑒別需要［3］，微生物菌群信息有助于預期常見菌群，并有助于評估清潔或消毒規程、方法、清潔劑或消毒劑及微生物監測方法的有效性，尤其當超過監測限度時，微生物鑒定信息有助于污染源的調査［6］。筆者在此參考《中國藥典》2015年版四部（通則9204）“微生物鑒定指導原則”，結合實際，借助API鑒定系統，對潔凈室收集到的某一微生物進行鑒定，從而建立起微生物鑒定方法。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

生物安全柜（BSC-1300IIA2型，蘇州安泰空氣技術有限公司）；藥品恒溫保存箱（MRR-680，廣州萬寶特種制冷設備有限公司）。

培養基：胰酪大豆胨瓊脂培養基平板（TSA）；法國生物梅里埃公司API Staph試劑條；革蘭氏染液。

1.2菌株來源

進入潔凈室（B級）實驗人員戴好手套進行表面環境菌采集，用直徑55 mm的培養皿對實驗人員的五指長按10 s進行取樣，最終收集到1株環境菌。

2　試驗步驟

2.1待鑒定菌純化分離

挑取待鑒定菌，用平板劃線法將其接到TSA培養基平板上，于30～35℃純培養18～24 h，得到單一的細菌。

2.2革蘭染色及鏡檢結果

2.2.1涂片 取清潔無油的載玻片一塊，在玻片中央滴一滴純化水。以接種環挑取菌落，與水充分混勻制成薄涂片。

2.2.2干燥 玻片置于室溫自然風干。

2.2.3固定 用火焰固定菌體于玻片上，固定時只能用微熱，使玻片迅速通過火焰，以手背接觸玻片背面，以不燙手為宜。

2.2.4染色 將甲紫染液滴加在已固定的涂片上，染1 min后純化水洗干凈；滴加革蘭碘液作用1 min，水洗后瀝干；滴加95%乙醇脫色，側動玻片，至無紫色脫落為止（20～30 s），水洗；滴加番紅染液復染30 s～1 min，水洗，待干。

2.2.5鏡檢：已染色的玻片，自然風干或用吸水紙輕輕印在涂抹上將水吸干。干燥后，于涂抹處滴加香柏油一滴，鏡檢所觀察的現象為菌體呈球狀，紫色，為革蘭氏陽性球菌。

2.3試劑條的選擇、接種及培養［7］

2.3.1根據上述鏡檢結果，先進行過氧化氫酶試驗，直接滴加數滴觸酶試劑于已分離純化的培養物上，立即觀察結果，結果若產生氣泡，則為陽性反應。選取API Staph試劑條（鑒別對象：葡萄球菌和微球菌），然后按該試劑條要求進行接種。

圖1　菌種鑒定結果

2.3.2試劑條的準備：準備一個培養盒，倒入約5 ml水于盤的蜂窩小凹中，形成一個濕潤的環境。然后記錄菌株資料于盤的邊沿部分，從包裝中取出試劑條放到盤中。接種物的制備：小心開啟裝有對應的懸浮液的安瓿瓶，以接種針從分離物的平板上挑取已分純單個菌落至懸浮基物中，仔細研勻以達到均一的細菌懸液。試劑條的接種：將試劑條梢向前傾斜，置吸管或PSI滴管的頭靠在杯的邊緣，避免氣泡形成。用吸管將細菌懸液加入對應各小管。管下字母用“___”標示則表示此管要用礦物油覆蓋，“［___］”則表示用細菌懸液充滿管道，其余小管則只加滿杯部。

2.3.3將此試劑條放置于35℃的培養箱內培養24 h。

3　結果判讀與鑒定結果［8　］

試劑條經培養后，則可參考說明表按要求向需滴加反應試劑的管中滴入試劑，根據顏色判斷各個管為陽性反應或是陰性反應，將反應的“+”、“-”結果得出一組7位數的數碼，將數碼輸入apiweb軟件則可得出此菌種鑒定結果。根據API數碼檢索手冊中鑒定概率的說明，%id ≥99.9為“極好的鑒定”；%id 99.8～99.0為“很好的鑒定”；%id 98.9～90.0為“好的鑒定”；%id 88.9～80.0為“可接受的鑒定”；%id 79.9以下為“低分辨率”。

如圖1所示，可以看到“有意義的分類單位”以及“下一個分類單位”的鑒定率分別是96.1%和2.1%，表示待鑒定菌有96.1%的可能性是表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），而只有2.1%的可能性是產色葡萄球菌（Staphylococcus chromogenes），前者的鑒定率達到了“%id 98.9～90.0”，屬于好的鑒定。

4　小結

微生物鑒定是藥品微生物檢驗中的重要環節，對受控環境收集到的微生物進行分析和鑒定，有助于對微生物實驗室的環境進行有效監控。本文結合日常對受控環境微生物監控的實際工作，采用多種技術手段，對進入潔凈室（B級）實驗人員手套進行表面環境菌采集，最終收集到1株環境菌，并對此菌株進行分析，從而建立起微生物實驗室中細菌的鑒定方法與步驟。本方法具有操作簡單、快速、易推廣的優點。

參考文獻

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［3］陳偉盛，關倩明，朱榮峰，等. 藥限品微生物度檢查中微生物污染的鑒定和溯源分析［J］. 藥物分析雜志，2014，34（1）：58-63.

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［8］湯貝貝，何貴元，盧忠心. 血培養常見病原菌菌群分布及耐藥性分析［J］. 檢驗醫學與臨床，2010，7（9）：827-828.

Establishment and Exploration of identification of bacteria in microbiology laboratories

YANG Yanlan LIANG Jiawen Laboratory Center，Guangzhou Baiyunshan Tianxin Pharmaceutical CO.LTD，Guangzhou Guangdong 510300，China

【Abstract】

【中圖分類號】R927

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）09-0116-02

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.09.079

作者單位：廣州白云山天心制藥股份有限公司化驗中心，廣東 廣州510300