補陽還五湯中生物堿提取工藝的優化研究*

劉晨敏　范紅晶　張宇燕　楊潔紅　萬海同（浙江中醫藥大學，浙江杭州310053）

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補陽還五湯中生物堿提取工藝的優化研究*

劉晨敏范紅晶張宇燕△楊潔紅萬海同（浙江中醫藥大學，浙江杭州310053）

【摘要】目的優化補陽還五湯中總生物堿的提取工藝。方法用酸性染料比色法建立總生物堿含量的測定方法；采用L9（34）正交設計考察乙醇濃度、乙醇用量、提取次數等因素，以總生物堿含量為指標，優選總生物堿的提取工藝。結果補陽還五湯總生物堿的最佳工藝為：8倍量90%乙醇提取3次。結論優化的補陽還五湯總生物堿提取工藝條件，可為補陽還五湯方藥的深入研究奠定基礎，也可為相關制劑研究提供參考。

【關鍵詞】補陽還五湯總生物堿正交設計提取工藝

補陽還五湯為清代名醫王清任所創，載于《醫林改錯》中，具有補氣活血、化瘀通絡之功效，主治中風后遺癥，屬氣虛血瘀證，臨床主要用于治療中風和中風后遺癥引起的口角流涎、言語不清、肢體麻木、遺尿不禁、半身不遂等疾病［1-4］。前期研究表明，補陽還五湯中主要含有豐富的生物堿、黃酮、皂苷、多糖等多個有效部位，川芎嗪等生物堿類成分具有擴張血管、增加冠狀動脈血流量、改善微循環以及抑制血小板聚集等作用［5-7］，廣泛應用于心腦血管疾病的治療。本實驗通過正交實驗優化補陽還五湯中總生物堿的提取工藝，為補陽還五湯方藥的深入研究奠定基礎，為相關制劑研究提供參考。現報告如下。

1　材　料

AG135電子天平（靈敏度0.0001 g）：梅特勒-托利多儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花：購自北京同仁堂杭州藥店有限公司；鹽酸川芎嗪（110817-200305）來自中國藥品生物制品檢定所；其余均為分析純。

2　方法與結果

2.1對照品溶液的制備精密稱取鹽酸川芎嗪對照品5.5 mg，置10 mL量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，作為0.55 mg/mL的對照品溶液。

2.2供試品溶液的制備按補陽還五湯原方（黃芪60 g，當歸9 g，川芎6 g，赤芍9 g，桃仁9 g，紅花9 g，地龍9 g）稱取原藥材共111 g，加入8倍體積的70%乙醇回流提取3次，每次1 h，提取液減壓濃縮至100 mL，抽濾，濾液用石油醚萃取脫脂，回收石油醚，取下層液用70%的乙醇定容于150 mL。

2.3最大吸收波長的確定將對照品溶液、樣品供試液和空白對照液0.5 mL，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚綠指示液2 mL，置分液漏斗中，再加氯仿9.5 mL，充分振搖，靜置1 h，分取氯仿層，加無水Na2SO4脫水后，在350～700 nm波長范圍內進行掃描。結果顯示前兩者在415 nm均有最大吸收值，且吸收峰相同，而空白對照液在415 nm幾乎沒有吸收，故本實驗選擇415 nm為測定波長。

2.4標準曲線的繪制取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于分液漏斗中，分別加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=5.4）5.0 mL，溴甲酚綠指示液2 mL，充分振搖，靜置1 h，分取氯仿層，并定容至10 mL。加無水Na2SO4脫水后于415 nm下測定吸光度值，以吸光度（Asb）與其相對應的濃度（μg/mL）作線性回歸，得到線性回歸方程為：y=0.0225x-0.0045，r2=0.9992，線性范圍5.5～33.0 μg/mL。

2.5精密度試驗精密量取配制好的對照品溶液0.3 mL，置10 mL具塞錐形瓶中，依法測定吸光度，重復測定5次，計算其相對標準偏差RSD為0.17%，表明精密度良好。

2.6穩定性試驗取供試品溶液，依法顯色，每隔2小時測定其吸收度1次，結果表明，自加完顯色劑開始其吸光度在12 h內幾乎無變化，計算其相對標準偏差RSD為1.13%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定性較好。

2.7重現性試驗取同批藥材，制備供試品溶液，測定其含量，以定容液的濃度表示，重復進行6次。計算求得生物堿濃度的相對標準偏差RSD為2.03%，表明重現性較好。

2.8加樣回收率試驗取5份已知含量的同批藥材，分別加川芎嗪對照品，依法操作，測吸光度，計算得川芎嗪的平均回收率為96.80%，其相對標準偏差RSD 為2.16%。

2.9正交優化提取工藝實驗本實驗選擇乙醇濃度、溶劑用量、提取次數等3個因素，每個因素3個水平，采用L9（34）正交法安排實驗（見表1），按照“供試品溶液”項下方法，并以正交表的試驗條件制備供試品溶液，按“標準曲線”項下于415 nm測定吸光度，計算生物堿得率，正交實驗結果及方差分析見表2，表3。

表1　因素水平表

結果分析，以總生物堿得率為指標，則：影響因素程度依次為C＞A＞B。其中A因素：無顯著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。B因素：無顯著性影響，且Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。C因素：顯著性因素，且Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ。由上可見，最佳提取條件應為A3B2C3。

2.10工藝驗證取補陽還五湯藥材按最佳工藝條件進行提取3次，測定其生物堿得率，進行工藝驗證實驗。見表4，表明該最佳提取工藝得率較高，工藝基本可行。

表2　正交實驗結果

表3　方差分析表

表4　工藝驗證結果

3　討　論

影響補陽還五湯總生物堿提取的主要因素有乙醇濃度、提取次數、溶劑倍量、提取時間等。通過預試，本實驗確定以乙醇濃度、提取次數、溶劑倍量為考察因素，并設置了相應的不同水平。本實驗結果表明補陽還五湯總生物堿提取的最佳提取工藝為：加8倍量90%乙醇提取3次，得到補陽還五湯總生物堿的平均提取率為89.16%，該工藝及設備簡單，成本較低，可行性好，為補陽還五湯的進一步研究和制劑開發研究提供依據。

參考文獻

［1］陳冬，楊潔紅.補陽還五湯抗腦缺血作用的研究進展［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（1）：72-74.

［2］付珍萍，趙斌，秦展宏.補陽還五湯臨床應用規律探源［J］.甘肅中醫，2010，23（9）：66-68.

［3］黃愛華.補陽還五湯治療中風偏癱后遺癥臨床療效分析［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（3）：161-163.

［4］郭東明，郭亞榮.補陽還五湯臨床應用淺析［J］.亞太傳統醫藥，2015，11（8）：55-56.

［5］吳旋，汪欣，陳云歡，等.補陽還五湯對腦缺血大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP的影響研究［J］.中國醫學創新，2015，12（12）：30-32.

［6］龍建飛，張秋霞，王蕾，等.補陽還五湯治療缺血性中風藥理作用機制的研究進展［J］.世界中醫藥，2015，10（5）：805-807.

［7］羅銀河，葛金文，劉林.補陽還五湯治療缺血性中風的實驗研究進展［J］.中華中醫藥學刊，2015，33（2）：269-271.

Op timization of Extraction Process of Alkaloid in Buyang Huanwu Decoction

LIU Chenmin，FAN Hongjing，ZHANG Yuyan，et al.
Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

【Abstract】Objective：To optimize extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction. Methods：The determination of the content of total alkaloid was established with acid dye colorimetry method. With L9（34）orthogonal design experiment，and by inspecting the extraction ethanol，ethanol concentration，extraction etc，the best extraction technology of total alkaloid in Buyang Huanwu decoction was selected. Results：The best process was 8 times the amount of 90%ethanol extracted for 3 times. Conclusion：Optimization of extraction process of alkaloid in Buyang Huanwu decoction can lay the foundation for the further study and provide references for the relevant development of preparations.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Total alkaloid；Orthogonal design；Optimum extraction

中圖分類號：R289.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）02-0197-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.003

*基金項目：國家自然科學基金（No.81202636，81274176）；浙江省自然科學基金（No.LZ14H270001）；浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2016ZZ2010）

通信作者△（電子郵箱：yannoo7376＠sina.com）

收稿日期（2015-10-10）