Notch1蛋白高表達抑制破骨細胞增殖和分化

平依林??婁鋒??楊肖??張平口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院（四川大學），成都?610041

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Notch1蛋白高表達抑制破骨細胞增殖和分化

平依林??婁鋒??楊肖??張平
口腔疾病研究國家重點實驗室?華西口腔醫院（四川大學），成都?610041

[摘要]目的 ??探究體外培養條件下Notch1蛋白高表達對細胞核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和巨噬細胞集落刺激因子（MCSF）誘導的骨髓源破骨細胞增殖分化的影響。方法 ??體外培養Rosa-notch1轉基因小鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs），采用RANKL和MCSF刺激BMSCs向破骨細胞方向分化。培養至第3天，實驗組和對照組分別轉染攜帶Cre重組酶和綠色熒光蛋白（GFP）的重組腺病毒（Ad-Cre-GFP）和攜帶GFP的重組腺病毒（Ad-GFP），啟動實驗組Notch1高表達，采用實時聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測Notch信號通路成分（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1）、靶基因（Hes1）mRNA表達量以及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）在誘導后mRNA的表達量。采用TRAP染色法觀察破骨細胞增殖分化情況。結果 ??TRAP染色顯示實驗組破骨細胞形成數量明顯少于對照組（P<0.05）。與對照組相比，實驗組Notch1、Notch3、Jagged1、Delta3、Hes1?mRNA表達量明顯增高（P<0.05），TRAP的mRNA表達量明顯降低（P<0.05）。結論 ??Notch1高表達抑制RANKL和MCSF誘導的破骨細胞增殖分化。

[關鍵詞]Notch1； 破骨細胞； 骨髓間充質干細胞

牙槽骨吸收是各型牙周炎主要癥狀之一，牙槽骨吸收過程中破骨細胞的激活和功能亢進是關鍵環節，其增殖、分化受到Notch信號通路的調控[1-3]。研究破骨細胞增殖、分化過程中Notch信號通路調節作用，可以進一步了解牙槽骨吸收機制；抑制Notch信號通路可能成為治療牙槽骨吸收提供新依據。已有研究[1]表明，敲除骨髓源巨噬細胞Notch1，將促使其向破骨細胞方向分化。然而，Notch1蛋白高表達對破骨細胞增殖、分化有何影響，目前仍不明確。本研究旨在探討在體外培養條件下，Notch1蛋白高表達對破骨細胞增殖、分化的影響。

1??材料和方法

1.1??實驗動物

選取8周齡SPF級雄性轉基因小鼠Rosa-notch1（The?Jackson?Laboratory，美國）6只，體重（19±2）?g。

1.2??試劑

α-MEM、胎牛血清（Hyclone公司，澳大利亞），青霉素/鏈霉素（Hyclone公司，美國），腺病毒（上海漢恒生物有限公司），鼠重組細胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate?resistant?acid?phosphatase，TRAP）、巨噬細胞集落刺激因子（macrophage?colony-stimulating?factors，MCSF）（Peprotech公司，美國），染色試劑盒（Sigma公司，美國），TRIzol提取液（Invitrogen公司，美國），QuantiTect?反轉錄試劑盒、實時聚合酶鏈反應（reverse?transcription-polymerase?chain?reaction，RT-PCR）試劑盒（凱基公司，德國），ABI7300?RTPCR儀（Applied?Biosystems公司，美國）。

1.3??破骨細胞培養及病毒轉染

頸椎脫臼法處死8周齡雄性Rosa-notch1小鼠，75%乙醇浸泡消毒2?min，無菌條件下分離股骨及脛骨，剪斷兩側骨骺端，用注射器針頭插入斷端，將培養基輕輕沖洗骨髓腔于50?mL無菌離心管中。采用注射器吹打骨髓間充質干細胞（bone?marrow?stem?cells，BMSCs）呈懸浮液，過濾，計數，用α-MEM培養液將細胞密度調整至每毫升3×105個，加入10-5mol·L-1MCSF，混勻后鋪盤（48孔板），每孔培養基500 μL（含10?ng·mL-1MCSF)。37?℃、5%CO2條件下用完全培養基（含α-MEM培養基、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素）培養至第3天，實驗組和對照組培養基中分別加入1 μL 1010pfu·mL-1攜帶Cre重組酶和綠色熒光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）的重組腺病毒（Ad-Cre-GFP）和攜帶GFP的重組腺病毒（Ad-GFP），8?h換液，并加入10-5mol·L-1RANKL，致MCSF和RANKL終濃度均為10?ng·mL-1。轉染病毒36?h后觀察對照組和實驗組均出現綠色熒光（圖1），表明病毒轉染成功。培養第4天起每天全換液，加入新鮮配制的完全培養基（含10?ng·mL-1MCSF，10?ng·mL-1RANKL）。

1.4???采用RT-PCR法檢測Notch信號通路成分、下游靶基因Hes1及TRAP?mRNA表達量

培養至第8天時，去培養基，每6孔加入1?mL? TRIzol，靜置2~3?min后，將含有細胞的TRIzol轉至去RNA酶1.5?mL離心管，加入200 μL氯仿，振蕩，室溫放置3?min，12?000?r·min-14?℃離心15?min，轉上層水相至新去RNA酶1.5?mL離心管，加入異丙醇500 μL，混合后靜置10?min，12?000?r·min-14?℃離心10?min，去上清，加入1?mL?75%乙醇，振蕩混合2~ 3?min，10?000?r·min-14?℃離心5?min，倒掉上清，室溫放置20?min使RNA沉淀干燥，加20 μL經焦碳酸二乙酯處理雙蒸水至EP離心管中。紫外分光光度計測定RNA260?nm/RNA280?nm光密度值以檢測RNA樣品的純度和濃度。按QuantiTect?逆轉錄試劑盒標明的操作步驟進行逆轉錄，采用SYBR?GREEN試劑盒進行RT-PCR分析，檢測Notch信號通路成分（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1）、Hes1?mRNA表達量以及TRAP在誘導后mRNA的表達量。設計針對基因與β-actin內參照的引物，具體如下。Notch1正義鏈5’-CTGAGGCAAGGATTGGAGTC-3’，反義鏈5’-GAATGGAGGTAGGTGCGAAG-3’；Notch2正義鏈5’-TGTGCCGTTGTGGTAGGTAA-3’，反義鏈5’-TGCTGTGGCTCTGGCTGT-3’；Notch3正義鏈5’-GAATCTGGAAGACACCCTGG-3’，反義鏈5’-AAGCGTCTCCTGGATGCTG-3’；Notch4正義鏈5’-TTCTGTCCCTCATAGCCTGG-3’，反義鏈5’-GGATAATATGAACCCCTGCG-3’；Delta1正義鏈5’-CTCCCCTGGTTTGTCACAGT-3’，反義鏈5’-GGAGAAGATGTGCGACCCT-3’；Delta3正義鏈5’-GTTCCCATCACAAGGTCCAG-3’，反義鏈5’-TCCCTGTCTCCACCAGTAGC-3’；Delta4正義鏈5’-TATAACCCTTTGGCCCACTG-3’，反義鏈5’-ATGGGGAGGTCTGTTTTGTG-3’；Jagged1正義鏈5’-GGCGAAACTGAAAGGCAGTA-3’，反義鏈5’-GCTTCGGCTCAGGGTCTAC-3’；Hes1正義鏈5’-GGTATTTCCCCAACACGCT-3’，反義鏈5’-GGCAGACATTCTGGAAATGA-3；TRAP正義鏈5’-GCAAGGTCCCCAACGGCTATC-3’，?反義鏈5’-GCCTCGGCAGCCTGGTCT-3’。

PCR反應體系均為20 μL，反應液各成分分別為SYBR?Premix?Ex?Taq?Ⅱ10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O 6.0 μL，ROXReference?Dye?Ⅱ0.4 μL。每組4個復孔。其相對表達量采用ΔΔCt方法計算。

1.5??TRAP染色及TRAP陽性細胞計數

將小鼠BMSCs接種于48孔板中，按上述分組培養，培養結束后棄去培養基，PBS洗滌2次。4%多聚甲醛液固定10?min，PBS洗2次，37?℃條件下用TRAP染色液染色30?min，雙蒸水洗3次。顯微鏡下觀察并進行破骨細胞計數，將細胞核數目3個或3個以上，且TRAP染色呈陽性的細胞視為破骨細胞。

圖 ?1??病毒轉染細胞后，小鼠BMSCs細胞表達GFP??熒光顯微鏡 ?×?40?Fig?1??BMSCs?those?transfected?successfully?expressed?GFP??fluo-??rescence?microscope??×?40

1.6??統計學分析

采用SPSS?18.0統計軟件包進行分析，破骨細胞數目以均數±標準差表示，采用t檢驗分析兩組破骨細胞數量是否具有統計學意義，檢驗水準α=0.05。

2 ?結果

2.1??Notch信號成分、下游靶基因Hes1及TRAP?mRNA?????的表達量

RANKL和MCSF誘導Rosa-notch1小鼠BMSCs向破骨方向分化至第8天，檢測2組Notch信號成分、Hes1、TRAP?mRNA的相對表達量，實驗組和對照組Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Delta1、Delta3、Delta4、Jagged1、Hes1、TRAP?mRNA表達量比值分別為2.546±0.435、1.784±0.342、1.980±0.188、0.876± 0.197、1.261±0.361、2.162±0.302、1.084±0.154、3.093±0.376、2.750±0.081、0.421±0.012。2組Notch1、Notch3、Delta3、Jagged1、Hes1、TRAP?mRNA表達量差異具有統計學意義（P<0.05）。實驗組破骨細胞中Notch1、Notch3、Jagged1、Delta3、Hes1表達量顯著高于對照組（P<0.05），提示Notch信號通路參與骨髓源破骨細胞增殖分化過程。同時，實驗組破骨細胞中TRAP?mRNA相對表達量卻明顯低于對照組（P<0.05），提示Notch1高表達抑制破骨細胞增殖分化。

2.2??破骨細胞的TRAP染色

培養至8天時破骨細胞數目及大小出現明顯差異，此時行TRAP染色，顯微鏡下觀察可見，對照組破骨細胞較實驗組數目多，分化成熟（圖2）。實驗組和對照組破骨細胞的形成數量分別為（111.5± 6.6）和（191.8±23.8）個，二者間差異有統計學意義（P<0.05）。

圖 ?2??TRAP染色后破骨細胞的形態 ?體視顯微鏡 ?×?25?Fig?2??Osteoclasts?morphology?with?TRAP?staining??stereomicro-??scope??×?25

3 ?討論

在哺乳動物中，Notch信號通路成分簡單，包括4種受體（Notch1、2、3、4）和5種配體（Jagged1、2，Delta?1、3、4）和DNA結合蛋白。相鄰細胞膜上受配體相互作用，Notch受體胞內段（Notch?intracellulardomain，NICD）從膜上釋放，NICD進入細胞核后與DNA結合的抑制蛋白轉化為轉錄激活因子，激活下游靶基因的表達，從而調控多種細胞的增殖、分化過程[4-5]。破骨細胞增殖分化受到Notch信號通路的調節[6-7]。在牙周炎中，破骨細胞分化的激活和功能亢進是牙周病牙槽骨吸收的關鍵環節[8]，對破骨細胞分化調控機制的探討，可進一步了解牙周病過程中牙槽骨吸收原理，為防治牙槽骨吸收提供新思路。

在本研究中，為了使Notch信號通路激活，將Rosa-notch1小鼠BMSCs由RANKL和MCSF誘導分化培養至第3天實驗組和對照組細胞分別進行Ad-Cre-GFP病毒和Ad-GFP病毒轉染。Ad-Cre-GFP病毒轉染成功后表達Cre重組酶和GFP，Cre重組酶可由2個各含有一個lox序列的核酸序列進行位點特異性重組，使Rosa-notch1小鼠BMSCs內終止子敲除，從而啟動Notch1蛋白高表達激活Notch信號通路。而Ad-GFP病毒轉染后，只表達GFP，無Cre重組酶，因此不能啟動Notch1高表達。細胞培養至第8天，大量破骨細胞形成，實驗組破骨細胞中多種Notch信號成分及下游靶基因表達增強，TRAP?mRNA表達量降低。Notch1高表達后，Delta3、Jagged1配體mRNA表達量上升，提示參與破骨細胞分化的受配體對可能是Notch1-Jagged1或Notch1-Delta3。Notch1高表達后，多核破骨細胞的數量明顯減少，提示在體外培養環境下，Notch1高表達可能抑制骨髓源破骨細胞的增殖、分化過程。該研究在體外實驗中通過病毒轉染，成功啟動Notch1蛋白高表達來刺激Notch信號通路，是本研究一大創新之處。但本研究也存在一定不足：本研究僅采用體外培養破骨細胞方式進行實驗，但體外環境與體內環境存在差異，所以仍需在轉基因小鼠體內進行基因敲除來進一步驗證實驗結果。

與本研究類似，Bai等[1]研究表明，體外敲除骨基質巨噬細胞中的Notch1可以促進破骨細胞前體的增殖與分化。王汝杰等[9]研究認為Jagged1可以抑制RAW264.7細胞的增殖，而加入DAPT阻斷Notch通路后Jagged1抑制RAW264.7細胞增殖作用明顯減弱。以上研究結果也提示Notch信號通路對破骨細胞有抑制作用。

Sekine等[10]研究提示Dll?1通過與Notch?2受體結合促進破骨細胞分化，并且在破骨前體細胞向破骨細胞分化過程中，Dll?1/Notch?2間的正向調控效應為主導作用。何飛等[11]研究提示，參與RAW264.7細胞向破骨細胞分化的主要受-配體對可能是Notch2-Jagged1。

目前關于Notch1蛋白對破骨細胞增殖、分化的影響仍存在差異，其原因可能是：首先，各文獻中破骨細胞所處的狀態有差異，眾所周知，在體內實驗和體外實驗中細胞所處微環境迥異，可能導致細胞對外界刺激的反應有差異。其次，Notch信號通路包含多種受體配體，研究[12-13]提示Notch信號通路中不同受體配體組合在同一細胞中可能發揮不同的作用，所以不同Notch受-配體組合在破骨細胞分化作用機制是否相同仍有待研究。

總之，筆者的研究提示Notch1蛋白參與并抑制體外培養條件下骨髓源破骨細胞的增殖分化，但其具體機制仍不甚明確，值得進一步探討。

[參考文獻]

[1]?Bai?S,?Kopan?R,?Zou?W,?et?al.?NOTCH1?regulates?osteoclastogenesis?directly?in?osteoclast?precursors?and?indirectly?via?osteoblast?lineage?cells[J].?J?Biol?Chem,?2008,?283(10): 6509-6518.

[2]?Teitelbaum?SL.?Bone?resorption?by?osteoclasts[J].?Science,?2000,?289(5484):1504-1508.

[3]?沈逸,?何東儀.?調控破骨細胞分化發育的信號轉導通路的研究進展[J].?現代免疫學,?2013,?33(4):341-345,?349. Shen?Y,?He?DY.?The?research?progress?of?signaling?pathways?regulating?osteoclasts?differentiation?and?development[J].?Modern?Immunol,?2013,?33(4):341-345,?349.

[4]?Artavanis-Tsakonas?S,?Rand?MD,?Lake?RJ.?Notch?signaling:?cell?fate?control?and?signal?integration?in?development[J].?Science,?1999,?284(5415):770-776.

[5]?Chiba?S.?Notch?signaling?in?stem?cell?systems[J].?Stem?Cells,?2006,?24(11):2437-2447．

[6]?Engin?F,?Yao?Z,?Yang?T,?et?al.?Dimorphic?effects?of?Notch?signaling?in?bone?homeostasis[J].?Nat?Med,?2008,?14(3):299-305.

[7]?Engin?F,?Lee?B.?NOTCHing?the?bone:?insights?into?multifunctionality[J].?Bone,?2010,?46(2):274-280.

[8]?Racz?GZ,?Kadar?K,?Foldes?A,?et?al.?Immunomodulatory?and?potential?therapeutic?role?of?mesenchymal?stem?cells?in?periodontitis[J].?J?Physiol?Pharmacol,?2014,?65(3):327-339.

[9]?王汝杰,?劉復州,?沈偉偉,?等.?Jagged1活化Notch通路促進RAW?264.7向破骨細胞分化但抑制增殖[J].?中國免疫學雜志,?2014,?30(7):865-869.?Wang?RJ,?Liu?FZ,?Shen?WW,?et?al.?Jagged1?promotes?osteoclast?differentiation?and?inhibits?proliferation?by?activating?of?Notch?signaling?pathway?induced[J].?Chin?J?Immunol,?2014,?30(7):865-869.

[10]?Sekine?C,?Koyanagi?A,?Koyama?N,?et?al.?Differential?regulation?of?osteoclastogenesis?by?Notch2/Delta-like?1?and?Notch1/Jagged1?axes[J].?Arthritis?Res?Ther,?2012,?14(2): R45.

[11]?何飛,?吳勇,?周艷.?Notch信號促進核因子κB受體活化因子配體誘導的破骨細胞分化的體外研究[J].?華西口腔醫學雜志,?2015,?33(1):25-28.?He?F,?Wu?Y,?Zhou?Y.?Notch?signaling?promotes?receptor?activator?of?nuclear?factor?kappa?B?ligand-induced?ostoclastogenesis?of?RAW264.7?cells?in vitro[J].?West?China?J?Stomatol,?2015,?33(1):25-28.

[12]?Matsuo?K,?Irie?N.?Osteoclast-osteoblast?communication[J].?Arch?Biochem?Biophys,?2008,?473(2):201-209.

[13]?Jaleco?AC,?Neves?H,?Hooijberg?E,?et?al.?Differential?effects?of?Notch?ligands?Delta-1?and?Jagged-1?in?human?lymphoid?differentiation[J].?J?Exp?Med,?2001,?194(7):991-1002.

（本文采編 ?石冰）

[中圖分類號]Q?257

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.003

[收稿日期]2015-07-20；?[修回日期] ?2015-11-06

[作者簡介]平依林，碩士，E-mail：771319243@qq.com

[通信作者]張平，教授，博士，E-mail：pingzhang68@hotmail.com

Up-regulation of Notch1 inhibits proliferation and differentiation of osteoclast in vitro

Ping Yilin, Lou Feng, Yang Xiao,Zhang Ping. (State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Correspondence: Zhang Ping, E-mail; pingzhang68@hotmail.com.

[Abstract]Objective ?This?study?aimed?to?explore?the?effect?of?the?up-regulation?of?Notch1?on?osteoclastogenesis?induced?to osteoclasts by receptor activator for nuclear factor-κB ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factors (MCSF) in vitro. Methods ??The?bone?marrow?stem?cells?(BMSCs)?of?Rosa-notch1mice?were?cultured?and?induced?to?osteoclasts?by?RANKL?and?MCSF.?The?BMSCs?were?transfected?with?the?Ad-Cre-green?fluorescent?protein?(GFP)?virus?or?Ad-GFP?virus.?Total?RNA?from?cells?was?extracted,?and?the?gene?expression?levels?of?Notch1,?Notch2,?Notch3,?Notch4,?Delta1,?Delta3,?Delta4,?Jagged1,?Hes1,?and?tartrate?resistant?acid?phosphatase?(TRAP)?were?detected?at?the?defined?stage?by?reverse?transcriptionpolymerase?chain?reaction?(RT-PCR).?Osteoclast?formation?was?analyzed?by?TRAP?assay.?Results ?The?number?of?TRAP-positive?multinuclear?cells?of?the?experimental?group?significantly?decreased?compared?with?that?of?the?control?group.?The?mRNA?expression?levels?of?Notch1,?Notch3,?Jagged1,?Delta3,?and?Hes1?of?the?experimental?group?were?significantly?higher?than?those?of?the?control?group,?whereas?the?TRAP?mRNA?expression?of?the?experimental?group?was?significantly?lower?than?that?of?the?control?group?(P<0.05).?Conclusion ?Up-regulation?of?Notch1?inhibit?osteoclastogenesis?of?BMSCs?induced?by?RANKL?and?MCSF?in vitro.

[Key words]Notch1;??osteoclast;??bone?marrow?stem?cells