Notch和Wnt信號通路在自體骨髓間充質(zhì)干細胞復合富血小板纖維蛋白修復兔牙槽骨缺損中的表達

周春梅??李淑慧??溫齊古麗·乃庫力??于莉??袁萍??趙璐??吳佩玲??尼加提·吐爾遜新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊?830063

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Notch和Wnt信號通路在自體骨髓間充質(zhì)干細胞復合富血小板纖維蛋白修復兔牙槽骨缺損中的表達

周春梅??李淑慧??溫齊古麗·乃庫力??于莉??袁萍??趙璐??吳佩玲??尼加提·吐爾遜
新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院口腔科，烏魯木齊?830063

[摘要]目的 通過建立自體骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）復合富血小板纖維蛋白（PRF）修復兔拔牙窩骨缺損的動物模型，探討Notch和Wnt信號通路在牙槽骨缺損修復過程中的表達及意義。方法 選用36只健康雄性2月齡新西蘭兔，隨機分為4組，均于全身麻醉下微創(chuàng)拔除下頜左側中切牙。A組植入BMSCs-PRF復合物，B、C組分別植入單一PRF和BMSCs，D組未植入任何材料作為空白對照。術后4、8、12周（每個時間點3只動物）處死動物，立即在骨缺損同一部位取材，制作骨標本，利用免疫組織化學和免疫熒光染色檢測骨缺損修復過程中Notch1和Wnt3a的表達情況。結果 免疫組織化學染色結果顯示：第4、8周，A、B、C組Notch1和Wnt3a表達均高于D組（P<0.05）；第12周，D組Notch1和Wnt3a表達高于其他3組（P<0.05）。免疫熒光染色顯示：第4周，骨缺損區(qū)新生骨細胞Notch1和Wnt3a的表達最多，隨著時間的延長，骨缺損修復完成，表達逐漸降低。結論 Notch1和Wnt3a信號分子在BMSCs復合PRF促進骨缺損修復過程中均有表達，可以通過調(diào)控BMSCs的增殖與分化加速牙槽骨缺損修復的愈合過程；二者表達情況相似，有可能存在串話機制。

[關鍵詞]Notch1； Wnt3a； 牙槽骨缺損； 骨髓間充質(zhì)干細胞； 富血小板纖維蛋白

拔牙后不可避免的牙槽骨吸收會導致牙槽嵴高度和寬度降低以及骨密度減小，會對后期活動和種植義齒修復的臨床效果產(chǎn)生不利影響[1-2]，因此牙槽骨缺損的修復是目前臨床上亟待解決的問題。在特定微環(huán)境中，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone?marrow?stem?cells，BMSCs）在適宜細胞因子作用下可以分化成多種組織細胞，如成骨細胞、軟骨細胞以及脂肪細胞等[3]。研究[4-5]證實，BMSCs與富血小板纖維蛋白（platelet-rich?fibrin，PRF）形成的骨組織工程復合材料可以促進牙槽骨的再生與修復，但如何促進細胞生成的調(diào)控機制目前尚不清楚。目前發(fā)現(xiàn)，Notch 和Wnt信號通路幾乎涉及所有已知動物的胚胎發(fā)育和組織損傷修復中細胞的增殖和分化活動，其中，Notch1和Wnt3a在口腔組織中的表達具有細胞特異性[6]，二者調(diào)控骨形成的機制是近年來的研究熱點。

本實驗采用BMSCs和PRF復合物BMSCs-PRF修復兔牙槽骨缺損，通過免疫組織化學和免疫熒光染色檢測不同時間段Notch1和Wnt3a信號蛋白在牙槽骨缺損前后的表達情況，分析Notch和Wnt雙信號通路在骨組織工程材料修復牙槽骨缺損中的作用。

1??材料和方法

1.1??主要試劑和儀器

大鼠抗兔一抗Notch1（北京博奧森生物技術有限公司），大鼠抗兔一抗Wnt3a（Ana?Spec公司，美國），Envision兩步法免疫組織化學試劑盒（DAKO公司，丹麥）；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）、抗體稀釋液、封閉用正常羊血清（北京中杉金橋生物技術有限公司）；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4’,6-diamidino-2-phenylindole?dihydrochloride，DAPI）（北京高科恒輝技術發(fā)展有限公司）；免疫熒光二抗試劑盒（Abbkine公司，美國）。C2型激光掃描共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）；DM5000型正置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；生物組織包埋機（金華益迪醫(yī)療設備有限公司）；Microm?HM?315型病理切片機（GMI?公司，德國）。

1.2??實驗方法

1.2.1???動物模型建立方法 ??健康雄性2月齡新西蘭大白兔36只（質(zhì)量2.5～3.5?kg，新疆醫(yī)科大學動物實驗中心），隨機分為4組，即實驗組（A、B、C）和空白組（D），均于全身麻醉下微創(chuàng)拔除下頜左側中切牙。A組植入自體BMSCs與PRF復合物BMSCs-PRF，B、C組分別植入PRF和BMSCs，D組拔牙窩內(nèi)未植入任何材料。分別于術后4、8和12周（每個時間點每組有3只動物）處死動物并立即在骨缺損部位取材，0.9%氯化鈉溶液沖洗下頜骨缺損部位標本，放入固定液（4%多聚甲醛）中固定48?h。標本經(jīng)過脫鈣、包埋，切片（厚度4 μm）后部分用于組織學觀察，部分進行免疫熒光和免疫組織化學染色。

1.2.2??BMSCs的體外培養(yǎng) ??A和C組的每只新西蘭大白兔均采用3%戊巴比妥鈉（1?mL·kg-1）通過耳緣靜脈注射麻醉后，選股骨第3轉子稍下方為進針點，持16號骨髓穿刺針與股骨軸線垂直刺入骨髓腔，抽取5?mL骨髓，采用細胞密度梯度離心法在超級工作臺內(nèi)分離并收集細胞。在37?℃、體積分數(shù)5%?CO2的飽和濕度孵育條件下，采用DMEM液（含體積分數(shù)10%胎牛血清、100?U·L-1青霉素、100?mg·L-1鏈霉素）培養(yǎng)細胞，首次換液48?h后，每間隔2～3?d換液1次。待顯微鏡下顯示細胞生長融合達90%以上后，用0.25%胰酶消化細胞2?min，離心5?min（1?200?r·min-1）。按照常規(guī)1∶2的比例傳代、擴增，取第3代細胞用于實驗。

1.2.3???PRF的制備 ??從A和B組的每只新西蘭大白兔耳緣抽取10?mL動脈血，放置于無菌采血管中，以3?000?r·min-1離心15?min后，管內(nèi)出現(xiàn)分層，由下至上依次為紅細胞層、白色凝膠狀PRF層、血清層。采用中間PRF層進行實驗。

1.2.4???BMSCs與PRF的復合及培養(yǎng) ??無菌條件下將PRF層制備成4?mm×6?mm大小后置于24孔板內(nèi)，用DMEM預濕后，紫外線消毒45?min。調(diào)整細胞密度至每毫升6×107個細胞，將BMSCs接種至24孔板內(nèi)，每塊接種20 μL，加培養(yǎng)液2?mL，在37?℃、體積分數(shù)5%的飽和濕度條件下孵育，間隔1?d換液，在倒置相差顯微鏡下每日觀察，培養(yǎng)至第3天時用于實驗。1.3??免疫熒光染色

切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，使用檸檬酸鈉緩沖液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。待抗原修復后，依次使用PBS清洗和10%正常山羊血清封閉。37?℃避光孵育1?h后，加入Notch1單克隆抗體（1∶100）及Wnt3a多克隆抗體（1∶100），置于4?℃冰箱內(nèi)孵育過夜。PBS清洗3次，加入二抗進行熒光標記（1∶1?000），常溫下避光孵育2?h，再次經(jīng)PBS沖洗后，加入稀釋后的DAPI（DAPI與甲醇體積比為1∶1?000）染色5～10?min，PBS清洗3次，最后封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4??免疫組織化學染色

切片常規(guī)脫蠟，室溫下置于3%H2O2溶液中15?min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，然后利用枸櫞酸緩沖溶液行抗原熱修復12?min，隨即于40?min~1?h內(nèi)冷卻至室溫，滴加羊封閉血清30～50 μL，置于37?℃恒溫箱內(nèi)孵育30?min后，滴加一抗Notch1（1∶500），4?℃條件下濕盒內(nèi)孵育過夜。室溫放置1?h，滴加二抗后于濕盒內(nèi)37?℃恒溫孵育25?min，DAB顯色，蘇木素5?min均勻染色，脫水、透明、封片。Wnt3a（1∶300）染色實驗步驟同上。選取各時間點各組骨缺損部位的15個高倍鏡視野（放大400倍），拍攝圖片，利用Image?Pro?Plus軟件（Media?Cybernetics公司，美國）測量各組Notch1和Wnt3a平均光密度（average?optical?density，AOD）值。測量步驟如下：1）光密度校正，即本底修正；2）設置測量參數(shù)；3）描繪測量區(qū)域；4）設置色彩選擇，本研究采用色調(diào)、飽和度、亮度模式；5）測量描繪區(qū)域面積；6）測量積分光密度；7）計算出比值即為AOD。

1.5??統(tǒng)計學分析

采用SPSS?17.0軟件對Notch1和Wnt3a的表達進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計方法采用方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2??結果

2.1??組織學切片觀察

術后4周，A組見骨細胞和少量哈弗系統(tǒng)以及粗大密集的骨小梁；B、C組表現(xiàn)出不典型的骨組織結構和哈弗系統(tǒng)，骨小梁較稀疏，排列較為紊亂；D組為纖維組織，罕見成骨細胞。術后8周，A組新生骨及骨小梁逐漸增加，B、C組有少量新生骨形成，D組多為纖維結締組織。術后12周，A組缺損區(qū)新生的編織骨及板層骨里可見成熟的哈弗系統(tǒng)；B組可見較稀疏的骨小梁，新生的編織骨及板層骨充填少于A組；C組骨組織排列欠規(guī)則，成熟的哈弗系統(tǒng)少見；D組主要為纖維結締組織，可見少量骨樣組織生成（圖1）。

圖 1??第12周4組的組織學切片觀察 ??蘇木精-伊紅染色??×?20Fig?1??Typical?histological?sections?of?specimens?harvested?from?the?four?groups?12?weeks?after?operation??hematoxylin-eosin?staining??×?20

2.2??Notch1和Wnt3a的表達

2.2.1??免疫熒光染色 ?4周時，Notch1和Wnt3a在各組骨缺損區(qū)新生牙槽骨內(nèi)均有表達，主要定位于細胞外基質(zhì)，新生組織血管周均可見Notch1強表達，而細胞核未見Notch1和Wnt3a的表達（圖2、3）；隨著時間延長，各組Notch1和Wnt3a的表達均逐漸下降，到12周時，除D組有少量表達外，其他組已無明顯表達。

圖 2??第4周Notch1表達情況 ??免疫熒光染色 ??×?40Fig?2??The?expression?of?Notch1?four?weeks?after?surgery??immunofluorescence?staining??×?40

圖 3??第4周Wnt3a表達情況 ??免疫熒光染色 ??×?40Fig?3??The?expression?of?Wnt3a?four?weeks?after?surgery??immunofluorescence?staining??×?40

2.2.2??免疫組織化學染色 ??Notch1和Wnt3a陽性表達呈棕色，表達在骨小梁周圍、牙槽骨的成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞中。實驗4、8周時，4組均有陽性表達，A組表達最高，B、C組次之，D組最低（圖4、 5）；12周時，隨著骨形成時間的增加，A、B、C組的陽性表達水平低于D組。4組在不同時間點的AOD值見圖6。

圖 4??第4周Notch1表達情況 ??免疫組織化學染色 ??×?40Fig?4??The?expression?of?Notch1?four?weeks?after?surgery??immunohistochemical?staining??×?40

圖 5??第4周Wnt3a表達情況 ??免疫組織化學染色 ??×?40Fig?5??The?expression?of?Wnt3a?four?weeks?after?surgery??immunohistochemical?staining??×?40

圖 6??4組Notch1（左）和Wnt3a（右）表達的AOD值Fig?6??The?AOD?of?Notch1?(left)?and?Wnt3a?（right)?in?four?groups

由圖6可見，4周時，A組Notch1和Wnt3a表達量最高，高于其他各組（P<0.05），B、C組表達量較A組降低，但高于D組（P<0.05）；隨干預時間的延長，8、12周時A、B、C組表達量均逐漸降低，但8周時A組表達量仍高于其他各組，12周時A組表達量高于B、C組；D組則隨干預時間的延長，表達量逐漸升高，12周時，D組Notch1和Wnt3a表達量最高，高于其他3組（P<0.05）。

3??討論

牙槽骨缺損修復是一個持續(xù)的骨組織吸收和骨形成的過程[7]。Notch和Wnt信號對調(diào)控干細胞的增殖、分化、凋亡、黏附及維持均具有十分重要的作用[8]。兩者在成骨細胞的發(fā)生及骨形成中的作用是近年來的研究焦點。

Notch信號通路是一類穿膜受體蛋白[7]，其激活是通過位于細胞膜上的Notch受體與配體和細胞核內(nèi)的DNA結合蛋白間相互作用，釋放出胞內(nèi)段[9-11]，將原來的協(xié)同抑制復合物轉換為協(xié)同活化復合物，傳到細胞核，激活相關轉錄因子的表達，調(diào)節(jié)與細胞增殖和分化相關的基因轉錄。Wnt3a信號蛋白是Wnt信號通路家族的成員之一，是一種富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，通過旁分泌或自分泌作用與相鄰細胞膜上的受體相結合，激活細胞內(nèi)各級信號，調(diào)控相關基因的表達和目標細胞的增殖和分化[12]。

骨組織工程技術是由種子細胞、細胞因子和支架材料組成。BMSCs取材容易，在體外連續(xù)傳代多達30次，仍具有很強的成骨潛能。骨形態(tài)發(fā)生蛋白、維生素C、β-甘油磷酸鈉和堿性成纖維細胞生長因子等誘導物可促進其向成骨方向分化。與其他成骨種子細胞相比，BMSCs有著無可比擬的優(yōu)勢[13-14]。PRF為新一代血小板濃縮物，呈立體網(wǎng)狀，可提供細胞生存的三維空間，對骨組織修復的促進作用有賴于濃縮血小板被激活后α顆粒緩慢釋放出高濃度的各類生長因子和自身的纖維蛋白支架作用[15-16]。

本實驗通過建立兔牙槽骨缺損的動物模型，向牙槽窩回植不同的骨組織工程材料，結果顯示：4周時各組均表達Notch1和Wnt3a，其中A組表達最高，B、C組次之，D組最低。提示Notch1和Wnt3a不同程度參與調(diào)控骨髓干細胞向成骨細胞增殖和分化以及新骨形成，A組新骨形成量優(yōu)于B、C組。8周時，A、B、C組的Notch1和Wnt3a表達量下降，D組逐漸升高。12周時，各組表達量與4周時相比均有明顯下降，且A、B、C組Notch1和Wnt3a表達量均低于D組?？赡苁请S著骨缺損區(qū)新生骨增多并逐漸成熟，Notch1和Wnt3a不參與調(diào)控成熟的成骨細胞；而空白組（D組）的成骨細胞仍處于增殖分化狀態(tài)，骨形成正在進行，成骨效果較其他3組滯后，致使Notch1和Wnt3a的表達量增加。

本研究結果提示，在促進骨組織缺損的修復過程中，骨組織工程材料通過Notch和Wnt信號通道參與調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞增殖與分化，加速新骨形成。在生物材料逐步降解的同時，由于PRF有促細胞增殖與遷徙的立體網(wǎng)狀結構，易于種子細胞的附著并在預制形態(tài)的三維支架上生長，同時獲得營養(yǎng)物質(zhì)并進行氣體交換和排除廢料，BMSCs-PRF復合物能促進成骨細胞的不斷增殖，增加新骨形成量[15]。

與BMSCs-PRF復合物相比，單純使用PRF組的成骨效果略差；BMSCs組缺乏由PRF形成的細胞外基質(zhì)，使其植入的BMSCs失去依托，影響新骨形成的微環(huán)境，不能形成優(yōu)勢成骨細胞群，而使生長能力強的成纖維細胞入侵骨缺損修復區(qū)，形成纖維結締組織，阻礙新骨的形成[17]?？瞻捉M（D組）中缺乏細胞因子及具有定向分化能力的BMSCs，骨缺損區(qū)新骨形成的量明顯低于3個實驗組。

綜上所述，自體BMSCs復合PRF修復兔牙槽骨缺損的過程中，Notch1和Wnt3a信號分子在新骨形成區(qū)均存在表達。兩者在表達順序及調(diào)控作用上具有協(xié)同作用，共同調(diào)控BMSCs-PRF向成骨細胞的增殖與分化。在此過程中，兩者表達相似，兩條通路可能存在串話。

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（本文采編 ?王晴）

[中圖分類號]R?782

[文獻標志碼]A???[doi] ??10.7518/hxkq.2016.02.005

[收稿日期]2015-10-30；?[修回日期] ?2015-12-21

[基金項目]國家自然科學基金（81460103）；新疆維吾爾自治區(qū)青年科學基金（2013211B53）

[作者簡介]周春梅，碩士，E-mail：zcm420@126.com

[通信作者]尼加提·吐爾遜，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：kqnijate@ 126.com

The expressions of the Notch and Wnt signaling pathways and their significance in the repair process of alveolar bone defects in rabbits with bone marrow stem cells compounded with platelet-rich fibrin

Zhou Chunmei, Li Shuhui, Wen- qiguli·Naikuli, Yu Li, Yuan Ping, Zhao Lu, Wu Peiling, Nijiati·Tuerxun. (Dept. of Stomatology, The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830063, China)
Supported by: Natural Science Foundation of China (81460103); Youth Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (2013211B53). Correspondence: Nijiati·Tuerxun, E-mail: kqnijate@126.com.

[Abstract]Objective We?explored?the?expressions?of?the?Notch?and?Wnt?signaling?pathways?and?their?significance?in?the?repair?process?of?alveolar?bone?defects?by?establishing?animal?models?with?a?composite?of?autologous?bone?marrow?mesenchymal?stem?cells?(BMSCs)?and?platelet-rich?fibrin?(PRF)?to?repair?bone?defects?in?the?extraction?sockets?of?rabbits.?Methods??A?total?of?36?two-month-old?male?New?Zealand?white?rabbits?were?randomly?divided?into?four?groups,?and?the?left?mandibular?incisors?of?all?the?rabbits?were?subjected?to?minimally?invasive?removalunder?general?anesthesia.?BMSC-PRF?compounds,?single?PRF,?and?single?BMSC?were?implanted?in?Groups?A,?B,?and?C.?No?material?was?implanted?in?Group?D?(blank?control).?The?animals?were?sacrificed?at?4,?8?and?12?weeks?after?surgery,?the?bone?defect?was?immediately?drawn,?and?the?bone?specimens?underwent?surgery?after?four,?eight,?and?twelve?weeks,?with?three?rabbits?per?time?point.?The?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?the?repair?process?of?the?bone?defect?were?measured?via?immunohistochemical?and?immunofluorescence?detection.?Results??Immunohistochemistry?showed?that?the?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?Groups?A,?B,?and?C?were?higher?than?that?in?Group?D?at?the?fourth?and?eighth?week?after?operation?(P<0.05).?By?contrast,?the?expressions?of?Notch1?and?Wnt3a?in?Group?D?were?higher? than?those?in?Groups?A,?B,?and?C?at?the?twelfth?week?(P< 0.05).?Immunofluorescence?showed?that?the?expressions?of?both?Notch1?and?Wnt3a?reached?their?peaks?in?the?new?bone?cells?of?the?bone?defect?after?four?weeks?following?surgery?and?gradually?disappeared?when?the?bone?was?repaired?com-pletely.?Conclusion???Notch1?and?Wnt3a?signaling?molecules?are?expressed?in?the?process?of?repairing?bone?defects?using?BMSC-PRF?composites?and?can?accelerate?the?healing?by?regulating?the?proliferation?and?differentiation?of?BMSCs.?Moreover,?the?expressions?of?Notch?and?Wnt?are?similar,?and?a?crosstalk?between?them?may?exist.

[Key words]Notch1;??Wnt3a;??alveolar?bone?defect;??bone?marrow?stem?cells;??platelet-rich?fibrin