不同固定條件對幾種植物樣品超微結構的影響

李葉　黃華平　鄧睿　張新春　崔艷梅　盧雪蓮　林培群

摘 要 為比較幾種固定條件對不同植物材料樣品電鏡超微結構圖像清晰度的影響。以3個不同科屬4種植物[油棕（Elaeis gineansis Jacq.）、擬南芥（Arabidopsis thaliana.）、花生（Arachis hypogaea Linn.）、柱花草（Stylosanthes guianensias Sw.）]為研究主體代表，探討了2.5%戊二醛與4%戊二醛固定過夜、鋨酸固定2 h及過夜的制備方法對其葉片超微結構的影響，并成功觀察了柱花草接種膠苞炭疽野生型菌株CH008后的病菌侵入過程。結果表明：油棕、擬南芥、花生及柱花草葉片經4%戊二醛與1%鋨酸固定液固定過夜，其組織成像的效果均較為理想，各種細胞器整體信息豐富、結構組織完好、線條清晰。表明，此制備方法能夠較好的保存植物葉片和細胞組織，提高制樣的成功率及觀察分辨率。

關鍵詞 透射電鏡；植物樣品；制備方法；超薄切片；分辨率

中圖分類號 Q944 文獻標識碼 A

透射電鏡具有的高分辨率，直觀性的特點，是研究微觀組織結構的強有力工具，在農、林等科研上越來越得到重視和廣泛應用。目前已在植物保護，良種繁育，植物品種鑒定、性狀鑒別，成分分析，土壤改進，環(huán)境保護等多方面的科研中取得了顯著成績[1]。例如應用電鏡觀察植物組織的超微結構，探討其生長和發(fā)育機理，揭示植物結構與功能的關系，為改善植物功能和提高植物產量提供理論依據[2-7]；觀察植物器官在生長過程中的變異，為提高栽培技術提供依據[8-12]。而透射電鏡不能像光學顯微鏡一樣，可直接觀察活體樣品及經某些簡單的方法制得的樣品厚切片，它需對動物或植物組織進行固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片及染色等處理。由于步驟繁瑣，操作復雜，生物組織和細胞結構形態(tài)很可能發(fā)生某些變化。因此，在用透射電子顯微鏡觀察生物樣品前必須適當處理，根據實驗材料尋找合適的處理條件，使樣品損失程度最小，以求獲得較好的、較真實的觀察結果。

而固定是續(xù)取樣之后的第二步，同時也是電鏡生物樣品制備過程中最關鍵一步，甚至能影響觀察結果的成功與失敗[13-14]。固定的目的一是為了使組織在電鏡超薄切片制作過程中保持細胞的形態(tài)結構，使之各方面盡可能地接近于存活時的原有形態(tài)和結構，二是防止在以后的制備過程中，如脫水、滲透和包埋等丟失，并使其結構在電鏡下有較好的反差。固定的好壞將直接影響到最后的結果，倘若材料固定不理想，就是再高的分辨率也是毫無意義的。只有良好的固定，才有可能獲得真實而又優(yōu)美的形態(tài)學圖像。

但對于植物材料而言，由于植物細胞壁堅厚，致密組織，組織內空氣多或表面含蠟等因素，都會影響固定液的滲入，從而影響固定效果。目前，國內雖有不少關于植物樣品電鏡制備技術的報道[15-18]，但還未發(fā)現針對不同或同一的植物材料，有相同或統(tǒng)一的固定條件處理方法。尤其是對一個電鏡工作者，面臨著既要縮短科技人員的實驗時間，又要保證實驗順利進行，同時又獲得較真實、較好的實驗效果的問題。如果采用同一固定液成份、固定濃度及固定時間等固定條件，相同去處理大多科屬植物材料，是否也都能取得良好的固定效果或之間有又怎樣的關聯(lián)？為此，探討不同科屬、同科不同屬或同屬不同種科屬的植物材料，是否能采用統(tǒng)一的固定條件處理或建立一整套技術流程，既能提高工作效率，又能獲得較真實、高分辨率結構圖像是電鏡工作者深入研究的重要內容。因此，本研究擬在前人研究的基礎上，以棕櫚科油棕和十字花科擬南芥2種植物材料為例，希望通過不同的固定條件方法處理，對最后獲得的超薄切片電鏡觀察結果進行分析比較，篩選出最優(yōu)固定條件方法，最后通過同豆科不同屬植物花生和柱花草2種植物材料證明該固定條件下取得的效果，為電鏡初學者和農業(yè)科技工作者開展相關研究提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物樣品：棕櫚科油棕（Elaeis guineensis Jacq.）葉片；十字花科擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.]葉片；豆科花生（Arachis hypogaea Linn.）葉片；豆科柱花草（Stylosanthes guianensias Sw.）葉片。

試劑：25%戊二醛固定液（中鏡科儀）、鋨酸0.5 g（中鏡科儀）、樹脂Epon 812（中鏡科儀）

儀器：DHG-9203A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；LEICA EM UC6型超薄切片機，德國LEICA公司；HT-7700透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理 用剪刀將植物樣品沿葉脈方向剪成約0.5 mm3，迅速置于已預冷的戊二醛固定液中，并用注射器反復抽氣，直至樣品沉入固定液里，放入4 ℃冰箱過夜保存。次日，用0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）清洗干凈后，在1%鋨酸固定液固定并于4 ℃冰箱中保存，再用0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS）清洗干凈。樣品預處理過程如表1所示。

1.2.2 脫水 將上述預處理樣品分別經30%、50%、70%、80%、95%、100%乙醇梯度脫水10～20 min，100%無水丙酮脫水2～3次（每次10～20 min）。樣品若不能在當天進行滲透，可在70%乙醇中浸泡并置于4 ℃冰箱過夜。

1.2.3 滲透、包埋 采用丙酮，包埋劑為3 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 3梯度滲透法浸透，分別浸透2、3和24 h。然后分別在35 ℃烘箱中靜置12 h，45 ℃烘箱中靜置24 h，60 ℃烘箱中靜置48 h。

1.2.4 透射電鏡觀察 油棕、擬南芥及柱花草葉片組織經LEICA EM UC6型超薄切片機切片50～70 nm，自然晾干后，直接于HT-7700透射電鏡觀察；花生葉片組織經LEICA EM UC6型超薄切片機切片65 nm，經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，待晾干后，HT-7700透射電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 不同植物葉片的超微結構

2.1.1 油棕葉片的超微結構 油棕葉片較厚，細胞壁厚，組織堅硬，藥物難以滲透，是透射電鏡樣品制備難度大的典型。油棕超微結構如圖1所示。從圖1可看出，經4%戊二醛和1%鋨酸固定過夜處理后的超微結構圖像（圖1-a～g）稍優(yōu)于4%戊二醛和1%鋨酸固定2 h處理后的超微結構圖像（圖1-h～i），但彼此間差異不顯著，各種細胞器、結構均比較清晰、完整，且都能清晰觀察到葉綠體片層精細結構；而經2.5%戊二醛和1%鋨酸固定過夜處理后的超微結構圖像效果不如前2種處理方法（圖1-j～k），其葉綠體片層精細結構、細胞膜結構線條清晰度均有所下降。

2.1.2 擬南芥葉片的超微結構 擬南芥葉片含有豐富的液泡組織，在溶液中葉片難以下沉，也是較難固定的植物電鏡樣品之一。試驗結果超微結構見圖2。從圖2-a～d可以看出，擬南芥葉片經2種方法處理后，其組織均有較理想的成像效果，且彼此間無差異，各種細胞器整體信息豐富、結構保存良好，固定徹底，滲透均勻，沒有污染、腫脹、變形、顛顫、開裂等不良現象，結構清晰，可見葉綠體的全貌和葉綠體片層結構，同時能進行大視野結構觀察。說明此制備方法，對擬南芥葉片的損傷較小。

2.1.3 花生葉片組織的超微結構 花生葉片樣品試驗結果超微結構見圖3。從圖3-a～d可看出，經4%戊二醛與1%鋨酸固定處理的樣品，組織結構整體信息豐富，各種細胞器結構比較清晰、完整，葉綠體的全貌和葉綠體組織的片層結構清晰（圖3-a，b）。同時高爾基體、線粒體、液泡等均保存良好，微細的內質網也完整保留下來（圖3-c，d），線粒體內外膜完整，脊清晰，線粒體膜、細胞核和細胞器的雙層膜結構完整，沒有變形或斷裂。可見，此制備方法對花生葉片的損傷較小，也適合于豆科植物材料的制備，不僅能夠提高豆科植物樣品的分辨率，還能使切片顯示更多的微細結構。

2.2 柱花草接種CH008菌后葉片組織超微結構

柱花草葉片樣品試驗結果超微結構見圖4。接種24 h后葉片組織可見侵染釘（圖4-a），侵染釘穿過細胞壁侵入寄主細胞，形成侵染菌絲定植于寄主細胞（圖4-b），接種后48 h，菌絲在寄主細胞內蔓延（圖4-c），接種后96 h，寄主細胞的超微結構變化明顯（圖4-d），葉綠體基本崩解，淀粉粒數目增多，細胞核核膜完全裂解，線粒體嵴開始發(fā)生退化，內部顯空虛。試驗結果表明此制備方法可成功觀察CH008野生菌侵入柱花草的過程。

3 討論

想獲取高質量的透射電鏡超薄切片及超分辨率的電鏡圖片，與樣品的取材、固定、脫水、滲透、包埋和切片等制樣步驟息息相關，任何步驟出問題都會影響樣品超薄切片質量，甚至導致制樣失敗[19]。那么超薄切片質量的衡量標準首先是判斷樣品結構保存是否良好。而認定樣品結構的保存質量，則主要是依據細胞細微結構形態(tài)判斷。樣品固定效果好的細胞，在電鏡下可清晰觀察到細胞膜、細胞核和細胞器的雙層膜結構完整連續(xù)，沒有變形或斷裂，且雙層膜中間的間隔大小均勻一致，特別是線粒體結構，內外膜完整，基質致密，脊清晰，核染色質分布均勻等[20]。植物材料由于植物的細胞壁較厚，結構密集，生物形態(tài)特征、細胞結構以及細胞內含物等與其他生物有很大的差異，導致植物電鏡樣品的制備往往比其他的生物樣品制備更難以制備出高分辨的透射電鏡樣品[21-22]。本試驗采用的棕櫚科植物油棕葉片最厚，細胞壁堅硬，屬于最難固定的樣品之一，試劑最難以滲透；其次是十字花科擬南芥植物，擬南芥葉片含有較豐富的液泡組織，在溶液中難以下沉；而豆科植物相對前兩科植物來說，藥物較溶液滲透，且固定效果是最佳的。

楊勇驥[19]認為固定是標本制備過程中極為關鍵的一步，也是一種復雜的化學過程。某種組織應用哪種固定液、用哪一種緩沖液、用多少濃度、固定液的pH值及固定的時間和溫度等，都要經過預實驗。其中的每個因素都會影響固定的效果。組織細胞中蛋白質之間的交聯(lián)受固定液濃度影響較大。一般電鏡生物樣品的固定液常用濃度范圍是1%～6%，鋨酸用1%～2%[19]。若固定液濃度過低，則需較長時間固定，這易引起組織中酶的擴散，造成細胞物質的抽提及組織的腫脹。過高濃度固定液，尤其氧化固定劑類（如鋨酸和高錳酸鉀）易造成蛋白質分子的斷裂，損壞酶活性和細胞結構，使細胞過度收縮[19]。徐伯森[15]等采用3%戊二醛固定液固定2 h以上，鋨酸固定5 h處理擬南芥，結構清晰，沒有污染、腫脹、開裂等不良的現象出現。本實驗中采用4%戊二醛固定液固定過夜，1%鋨酸固定液固定過夜處理，也取得較佳的效果。

在理論上，低溫能降低酶的活性，減少細胞自溶和胞內物質的抽提，而室溫固定，則可加速固定液滲入組織的速度，且能增加固定劑與細胞組分之間的化學反應，但高溫（室溫）也能加速組織自溶。但在實踐中，室溫固定和低溫固定之間難以發(fā)現顯著的差別[20]。為了降低酶的活性、減少細胞自溶及胞內物質的抽提，目前多數實驗室把大部分樣品在0～4 ℃下固定。而確定合適的固定時間對固定效果也十分重要。因化學固定劑引起的抽提作用是隨時間延長逐漸積累的，若組織固定時間過長，也會造成某些成分抽提。尤其是組織經鋨酸長時間固定，會引起脂蛋白復合體的溶解，造成組織變脆，給超薄切片帶來困擾。劉仁林[16]等對雙子葉植物和單子葉植物采用2.5%戊二醛固定液在0～4 ℃條件下保存固定12～48 h，1%鋨酸固定液在-4 ℃條件下后固定12 h的預處理方法處理，不同類群的各種細胞器如質膜、葉綠體、前質體、油滴、液泡等都得到較好的保存；毛曉霞[17]等對紅楓葉片采用2.5%戊二醛固定液先4 ℃放置2～3 h，后在冰箱固定過夜，用1%鋨酸固定時間不超過4 h，細胞整體信息豐富，各種細胞器保存良好，沒有斷裂的細胞膜，細胞質基質分布均勻，細胞核清晰可見。本實驗同是在4 ℃下保存固定，但在對油棕植物材料的多次超薄切片實驗中，發(fā)現油棕切片上出現有波浪型條紋、顛痕或開裂現象較多，可能是由于脫水不徹底或樹脂受潮偏軟，或滲透不夠充分有關。

本試驗采用不同固定條件處理棕櫚科油棕和十字花科擬南芥樣品，結果表明，采用4%戊二醛與1%鋨酸固定液雙重固定過夜的方法，樣品組織得到的超微結構效果均較理想，細胞結構線條清晰，整體信息豐富、細胞質基質中充滿均勻精細顆粒，未見明顯空泡和顆粒性凝集現象。還通過了兩種豆科不同屬植物花生及柱花草樣品證明該方法的適合性，結果發(fā)現樣品組織結構也得到良好保存，連微管、內質網等微細結構也完整保存下來，各細胞器清晰可見。說明這種方法適應于棕櫚科、十字花科、豆科植物的電鏡樣品制備，可以在實踐中應用，并能獲得較好的效果。

參考文獻

[1] 王建林， 陸翠珍， 陳玎玎， 等. 電子顯微鏡在農業(yè)上的應用及進展[J]. 農技服務， 2010， 27（12）： 1 659-1 660.

[2] 郭興啟， 李向東， 王秀芳， 等.馬鈴薯Y病毒兩分離物特性及其侵染寄主的超微結構比較研究[J]. 浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版）， 2002， 28（4）： 411-416.

[3] 洪 健， 薛朝陽， 徐 穎， 等. 受番茄花葉病毒侵染后寄主的超微病變研究[J]. 植物學報， 1999， 41（12）： 1 259-1 263.

[4] 黃國紅， 康振生， 朱 之， 等. 小麥葉銹菌在感病寄主上發(fā)育的組織病理學和超微結構研究[J].植物病理學報， 2003， 33（1）： 52-56.

[5] 李照會， 郭興啟， 葉保華， 等. 感染玉米粗縮病毒后玉米植株的超微結構病變研究[J]. 中國農業(yè)科學， 2002， 35（3）： 264-266.

[6] 洪 健， 周雪平. 蠶豆萎焉病毒2號侵染豌豆的細胞病理變化[J]. 電子顯微學報， 2002， 21（5）： 560-561.

[7] 胡向武， 陳士超， 張林普. 黃瓜花葉病毒的侵染擴散及病變細胞的電鏡觀察[J]. 安徽師大學報（自然科學版）， 1998， 21（4）： 354-357.

[8] 臺蓮梅， 許艷麗， 閆鳳云. 尖孢鐮刀菌毒素對大豆胚根組織影響的超微結構研究[J].植物病理學報， 2006， 36（6）： 512-516.

[9] 蔣選利， 康振生， 李振岐， 等. 抗病品種中小麥條銹菌細胞的超微結構變化過程[J]. 菌物學報， 2005， 24（1）： 123-129.

[10]王桂榮， 郭予元， 吳孔明. 棉鈴蟲觸角感器的超微結構觀察[J].中國農業(yè)科學， 2002， 35（12）： 1 479-1 482.

[11] 鄭 玲， 吳小芹. 植物病原真菌侵染結構研究進展[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版）， 2007， 31（1）： 90-93.

[12] 楊洪鳳， 余向陽， 薛雅蓉. 內生解淀粉芽孢桿菌CC09在小麥根部定殖的電鏡觀察及防病效果[J]. 中國生物防治學報， 2014， 30（6）： 839-844.

[13] 徐是雄. 植物材料的薄切片、 超薄切片技術[M]. 北京： 北京大學出版社， 1981.

[14] 徐柏森. 生物電鏡技術[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2000.

[15] 徐伯森， 張耀麗， 何開躍， 等. 植物透射電鏡樣品制備技術探討[J]. 中國野生植物資源， 2006， 25（3）： 41-43.

[16]劉仁林， 虞功清， 鄒偉民， 等. 植物透射電鏡樣品制備技術的改進[J]. 江西林業(yè)科技， 2008（1）： 41-43.

[17] 毛曉霞， 黃敏毅. 透射電鏡樣品制備技術改良研究[J]. 現代農業(yè)科技， 2013（7）： 177-179.

[18] 尤華明， 劉銀春， 劉 寶， 等. 竹桿、 馬尾松莖木質材料超薄切片技術[J]. 福建林學院學報， 2007， 27（4）： 376-379.

[19] 楊勇驥. 實用生物醫(yī)學電子顯微鏡技術[M]. 上海： 第二軍醫(yī)大學出版社， 2003.

[20] 張景強. 生物電子顯微技術[M]. 廣州： 中山大學出版社， 1987.

[21] 徐是雄. 植物材料的薄切片、 超薄切片技術[M]. 北京： 北京大學出版社， 1981.

[22] 徐柏森. 生物電鏡技術[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2000.