水溶性的PEI化殼聚糖的合成

陶鳳

摘 要：殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產物，具有生物兼容性、生物降解性、無毒性。作為天然陽離子聚合物，殼聚糖具有正電性和特殊性能，因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好，單純殼聚糖轉染效率也不高，這就大大限制其應用范圍。為了提高殼聚糖的溶解性和轉染效率，對殼聚糖進行化學修飾極其必要。聚乙二醇能夠有效提高水溶性，當其與藥物相連時能增大分子量，減少腎消除延長半衰期，增加藥物穩定性，并且PEG鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原，降低藥物的免疫原性。我們通過合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物。合成的最終產物，不僅提高殼聚糖的水溶性和穩定性，提高轉染效率，而且由于引入大量的活性氨基，則便于殼聚糖的進一步修飾。反應合成的中間體和最終產物都通過1HNMR和FTIR表征。

關鍵詞：殼聚糖；基因載體；改性；聚乙二醇；聚乙烯亞胺

中圖分類號：O636 文獻標識碼：A

殼聚糖是天然聚多糖甲殼素的脫乙酰產物，具有生物兼容性、生物降解性、無毒性。作為天然陽離子聚合物，殼聚糖具有正電性和特殊性能，因而殼聚糖及其衍生物可廣泛用作藥物和基因載體。但是其水溶性不好，則大大限制其應用范圍。為此本課題通過對殼聚糖的修飾，旨在提高其水溶性。與此同時，殼聚糖作為基因載體，其轉染效率也不太理想。為此我們也通過對殼聚糖的修飾，提高含氮量來提高轉染效率。所以，通過修飾得到的殼聚糖衍生物水溶性好，轉染效率高，穩定性好，免疫原性低，可作為更加理想的基因載體使用。

1 水溶性的PEI化殼聚糖的合成實驗

在水溶性的PEI化殼聚糖的合成實驗中主要使用的是分子量2000的聚乙二醇單甲醚，當聚乙二醇與藥物相連時，能夠增大藥物的分子量，減少腎消除延長半衰期，增加藥物穩定性，并且PEG鏈包裹在藥物表面，能夠遮蔽藥物的抗原，降低藥物的免疫原性。

1.1 實驗合成路線

通過相關文獻的查閱，為合成目標產物O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖（mPEG-CS-N-MA-PEI），設計了如下的合成路線。首先完成碘代聚乙二醇單甲醚的合成，而后完成N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的合成，再次依次完成O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐殼聚糖的合成、O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的合成等。

1.2 實驗儀器及藥品

1.2.1 實驗儀器

NMR：Bruker AV400型核磁共振儀，真空泵（SHZ（Ⅲ）循環水式多用真空泵），FT-IR：Perkin-Elmer 2000型紅外光譜儀（KBr壓片），真空干燥箱（DZF-150型），加熱攪拌器（DF-10B集熱恒溫磁力攪拌器），水泵（SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵），旋轉蒸發儀（RE-5299），透析袋（截留分子量為8000-14000，北京索萊寶科技公司）。

1.2.2 實驗試劑

殼聚糖：南京衛康生物制品有限公司，脫乙酰度>90%，分子量48KDa；聚乙二醇單甲醚（mPEG）：韓國Hannong化學公司，分子量2KDa；聚乙烯亞胺（PEI）：武漢強龍化工有限公司，分子量2KDa；馬來酸酐：成都市科龍化工試劑廠，含量99.5%；亞磷酸三苯酯：成都市科龍化工試劑廠，含量98.0%；CH3I，DMSO，甲苯，乙醚，成都市科龍化工試劑廠。

1.3 實驗步驟

1.3.1 碘代聚乙二醇單甲醚（mPEGI）的制備

稱取10g MPEG加入50mL三頸燒瓶中，再加入1.3mL亞磷酸三苯酯和0.6mL碘甲烷，在氮氣保護下，升溫至120℃，攪拌下反應8h后停止。反應完畢后冷卻至室溫，抽濾，所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體，濾餅用乙醇索氏提取，直到提取液近乎無色為止。所得產品放置在紅外燈下干燥，碾碎得淺棕色粉末。產率：89%。

1.3.2 N-鄰苯二甲酸酐殼聚糖的制備

稱取5g殼聚糖和13.6g鄰苯二甲酸酐加入200mL單頸瓶中，再加入100mL DMF，升溫至130℃，攪拌條件下反應8h。反應完畢后冷卻至室溫，抽濾，所得濾液攪拌下倒入冰水中析出淺棕色固體，用乙醇洗滌兩次，所得產品放置在紅外燈下干燥，碾碎得淺棕色粉末。產率：92%。

1.3.3 O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖的制備

稱取1.5g鄰苯二甲酸酐保護的殼聚糖，8g MPEGI和0.8g Ag2O加入到500mL三口瓶中，充入氬氣，再加入90mL DMF，升溫至60℃，攪拌下條件下反應16h后，再加入60mL水合肼和100mL蒸餾水，升溫至90℃后接著再反應15h。反應完畢后冷卻至室溫，過濾，濾液濃縮，在濾液中加入硫酸鈉分液，取上層黃色油狀粗產物，裝入透析袋中透析4天，減壓濃縮，真空干燥，得淺色固體化合物。

1.3.4 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐殼聚糖的制備

稱取1.2g制備的O-聚乙二醇單甲醚殼聚糖加入100mL的三口瓶中，加入45mL DMSO充分溶解，然后加入0.9g馬來酸酐，繼續攪拌，升溫至60℃，反應8h后停止。將裝置改為減壓蒸餾裝置，蒸出大部分的溶劑DMSO，然后加入10mL的蒸餾水，倒入透析袋中透析3天，用旋轉蒸發儀旋干后再減壓抽干得0.7克白色固體。

1.3.5 O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖的制備

稱取0.5g已制備的mPEG-O-CS-N-MA溶于50mL蒸餾水中，然后加入250mL的三口瓶中，稱取4.8g的PEI溶于70mL蒸餾水中，倒入恒壓滴液漏斗中，升溫至60℃，攪拌下將PEI溶液滴入三口瓶中，反應48h。反應結束后，用稀鹽酸調節pH值至7，用旋轉蒸發儀旋出大部分水后透析三天，然后旋干，再減壓抽干得0.8g白色固體。

1.4 譜圖及譜圖分析

從實驗數據中可以看出，殼聚糖的紅外吸收為：1599cm-1（酰胺II，-NH2伸縮振動）和1383cm-1（酰胺III）處為殼聚糖的特征吸收峰。羥基中O-H的伸縮振動吸收峰和N-H的伸縮振動吸收峰在3442cm-1處。C-H伸縮振動吸收峰為2900cm-1和2873cm-1。1145cm-1為C-O-C彎曲振動吸收峰，仲羥基中C-O伸縮振動吸收峰為1093cm-1，1021cm-1為伯羥基中C-O伸縮振動吸收峰為。

合成后氨基被鄰苯二甲酸酐保護后，殼聚糖氨基的伸縮振動吸收峰1599cm-1消失。同時，在1712cm-1、1777cm-1處出現鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰。而且，在720cm-1和795cm-1處出現苯環的搖擺振動特征吸收峰，說明氨基已經被鄰苯二甲酸酐保護起來。

在聚乙二醇化殼聚糖的檢測中發現鄰苯二甲酰胺上羰基的特征吸收峰1712cm-1、1777cm-1消失，說明在水合肼中的作用下，鄰苯二甲酰基已完全被脫去，氨基被釋放出來。并且2886cm-1和1114cm-1左右的吸收峰的強度明顯高于殼聚糖，這是由于接枝了mPEG后殼聚糖衍生物中亞甲基和醚鍵大量增加所致。

由紅外譜圖中的數據可知，聚乙二醇化殼聚糖接枝馬來酸酐以后在1720cm-1出現了一吸收峰，這是接入馬來酸酐后形成特征吸收峰，表明了馬來酸酐成功接入殼聚糖。

通過測試數據表明，馬來酸酐化殼聚糖與PEI發生邁克爾加成后，1720cm-1處吸收峰消失，說明殼聚糖衍生物上的雙鍵與PEI的氨基發生反應。并且接枝PEI后引入了大量的氨基，所以在1600cm-1左右出現了氨基的特征吸收峰。這就表明PEI已經成功接枝到殼聚糖上形成預期的殼聚糖衍生物。

結語

為改進殼聚糖在基因載體方面的應用，提高殼聚糖的水溶性、穩定性、轉染效率和降低免疫源性，本課題合成了O-聚乙二醇單甲醚-N-馬來酸酐-聚乙烯亞胺殼聚糖衍生物，。合成的最終產物，不僅提高殼聚糖的水溶性和穩定性，提高轉染效率，而且由于引入大量的活性氨基，則便于殼聚糖的進一步修飾。由紅外譜圖分析可知，6位羥基的mPEG和2位氨基的PEI已經接上，得到了預期的產物。并且由于PEI的引入，引入了大量有反應活性的氨基，如果要進一步修飾衍生物，比如靶向性的引入半乳糖或者葉酸，則更加容易進行。因此PEI的引入，為殼聚糖衍生物的進一步研究奠定了基礎。實驗結果表明，這種殼聚糖衍生物的水溶性很好，水溶性的改進達到了預期的效果。而由于時間的限制，此衍生物在轉染方面的測試還沒來得及進行，還有待繼續研究。

參考文獻

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