HPLC法測定夏天無滴眼液中原阿片堿的含量

蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飛

(溫州醫科大學附屬眼視光醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000)

HPLC法測定夏天無滴眼液中原阿片堿的含量

蔡永豪，徐雪姑，林佩珍，郁引飛Δ

(溫州醫科大學附屬眼視光醫院 藥劑科，浙江 溫州 325000)

目的 建立測定夏天無滴眼液中原阿片堿含量的HPLC法。方法 采用ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)色譜柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液 (25:75)為流動相，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長290 nm，進樣量20 μL。結果 在該色譜條件下，原阿片堿在濃度14.2～142 μg/mL范圍內線性關系良好(r=0.9999,n=9),加樣回收率為104.5%，RSD為2.47%，日內和日間精密度RSD均小于1%(n=5)，樣品在24 h內穩定。結論 本方法簡單，結果準確可靠，重復性好，可以用于測定夏天無滴眼液中原阿片堿的含量。

夏天無滴眼液；原阿片堿；HPLC；含量測定

夏天無滴眼液主要功效為活血明目舒筋。用于血瘀筋脈阻滯所致的青少年遠視力下降、不能久視；青少年假性近視癥見上述癥候者。成份包含原阿片堿、四氫巴馬汀、球紫堇堿，以及其它少量各種植物堿。其主要成份普魯托品(原阿片堿)能直接松弛平滑肌，解除睫狀肌的緊張，其解痙作用比阿托品弱,但無阿托品那樣的散瞳及升高眼壓的副作用。中國藥典采用檢測原阿片堿的含量進行夏天無滴眼液的質量控制，文獻報道的原阿片堿等生物堿的含量測定方法有薄層掃描法[1-2]、毛細管電泳法[3]、HPLC法[4-10]、LC/MS法[11]等。薄層掃描法操作繁瑣,容易產生誤差。毛細管電泳法分離能力較弱，并且對pH值要求較高。液質聯用儀器使用成本較高。HPLC法能快速分離并檢測原阿片堿，且方法靈敏、準確，重復性好。但存在流動相配制復雜，樣品處置過程復雜，測定時儀器穩定時間長等缺點[4-10]。本研究在文獻[4-11]的基礎上，摸索建立了一種更簡便、快速、準確的測定夏天無滴眼液中主要成份原阿片堿含量的高效液相色譜方法，在實際樣品的含量分析中取得了滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Aglient1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；FA1104型電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)；滅菌注射用水(四川科倫藥業)；原阿片堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110853-201003，含量：99.9%)；夏天無滴眼液(江西珍視明藥業，批號：141101，150301，150901，規格：10 mL)；乙腈、三氟乙酸為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件及系統適應性：色譜柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%三氟乙酸(25:75)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：290 nm；進樣量：20 μL。主峰的拖尾因子小于2.0，理論板數按原阿片堿色譜峰計算不低于3000。

1.2.2 溶液的配制

① 對照品儲備液的配制：精密稱取五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h的原阿片堿對照品7.1 mg，置25 mL容量瓶中，加入流動相溶解并定容至刻度，搖勻、靜置。既得原阿片堿濃度為284 μg/mL的對照品儲備液。

② 供試品溶液的配制：精密量取夏天無滴眼液7.5 mL，置10 mL容量瓶中，加入流動相稀釋并定容至刻度，搖勻、靜置。即得原阿片堿濃度為281.25 μg/mL的夏天無供試品溶液。

1.2.3 方法學驗證

① 專屬性試驗：在色譜條件下，分別記錄對照品溶液、供試品溶液色譜圖。

② 線性關系考察：精密量取對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋到刻度，搖勻，即得濃度為：14.2、28.4、42.6、56.8、71、85.2、99.4、113.6、142 μg/mL系列溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，將原阿片堿峰面積(A)與濃度(C)進行回歸分析。

③ 精密度試驗：選取低、中、高3種濃度的原阿片堿對照品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進樣分析，1 d內重復測定5次，考察日內精密度；連續測定5 d，考察日間精密度。

④ 加樣回收率試驗：分別精密量取夏天無滴眼液1 mL置于15個10 mL容量瓶中。精密量取原阿片堿對照品儲備液1.2、1.5、1.8 mL各5份，分別置于上述10 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，按照“1.2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算回收率。

⑤ 耐用性試驗：在試驗中對流動相乙腈-0.1%三氟乙酸比例(23.7:76.3、25:75、26.3:73.7)、柱溫(25 ℃、30 ℃、 35 ℃)、 流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)條件進行考察。

⑥ 樣品含量測定：精密吸取夏天無滴眼液，稀釋20倍，按照“1.2.1”項下條件進樣測定峰面積，將測得峰面積代入回歸方程按外標法計算樣品中原阿片堿的含量。

⑦ 穩定性試驗：以批號150301的夏天無滴眼液按“1.2.3⑥”項下方法制備供試品溶液并于0、2、4、8、10、12、24 h進樣，進行測定。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.2.1 專屬性考察結果：結果原阿片堿的保留時間約為6.2 min，樣品溶液中主峰與其余各峰分離效果較好。色譜圖見圖1。

圖1 原阿片堿對照品(A)和夏天無滴眼液(B)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of protopine standard sample(A) and rhizoma corydalis decumbentis eye drops (B)

2.2.2 線性關系考察結果：原阿片堿峰面積(A)與濃度(C)進行回歸分析，得到線性方程：A=28.2207C-36.1446(r=0.9999，n=9)。結果表明原阿片堿濃度在14.2～142 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗結果：低、中、高濃度的原阿片堿對照品溶液日內精密度及日間精密度考察結果見表1。

表1 精密度試驗結果

2.2.4 加樣回收率試驗結果：回收率試驗結果見表2。

表2 加樣回收率試驗

2.2.5 耐用性試驗結果：當流動相比例、柱溫、流速發生細微變化時，對測定結果影響較小，主吸收峰與其它吸收峰均能夠達到基線分離，表明本方法耐用性較好。

2.2.6 樣品含量測定結果：樣品中原阿片堿的含量見表3。

表3 樣品含量測定結果

2.2.7 穩定性試驗結果：原阿片堿供試品0、2、4、8、10、12、24 h進樣，其峰面積的RSD為0.55%，結果表明樣品溶液在24 h內穩定。

3 討論

流動相選擇上本研究嘗試使用了以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%三氟乙酸和甲醇-0.1%三氟乙酸作為流動相系統，結果顯示使用乙腈-0.1%三氟乙酸作為流動相，色譜峰形、對稱性好，無需加入緩沖液，且三氟乙酸較三乙胺粘度低，可以較方便地從制備樣品中除去。原阿片堿的保留時間是6.2 min，與文獻[12]報道的原阿片堿保留時間12.6 min相比，可以縮短原阿片堿的保留時間，提高了分析的效率。

本研究建立了高效液相色譜測定夏天無滴眼液中原阿片堿含量的方法，采用樣品稀釋后直接進樣，流動相不需用三乙胺調節，更為簡化。在不影響分離效果的情況下原阿片堿出峰時間縮短,提高了工作效率，方法簡便快速，結果準確可靠，重現性好，為該藥品質量控制提供依據。

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[2]羅躍華，熊蔚，吳朝陽.薄層掃描法測定夏天無片中原阿片堿的含量[J].中成藥，1999，31(10)：531-532.

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[8]朱才慶，范其坤，熊勝泉,等.HPLC法測定夏天無注射液中原阿片堿[J].中草藥，2005，36(5)：699-700.

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[11]沈燕，韓超，劉翠平,等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定夏天無中的4種生物堿[J].色譜，2011，29(2)：176-179.

[12]周利賢.HPLC法測定夏天無注射液中原阿片堿的含量[J].中國藥師,2010，13(10)：1454-1455.

(編校：王儼儼)

Determination of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops by HPLC

CAI Yong-hao, XU Xue-gu, LIN Pei-zhen, YU Yin-feiΔ

(Department of Pharmacy,The Affiliated Eye Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of content of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.MethodsThe HPLC separation was carried out on a ZORBAX SB-C18(150 mm×46 mm，5 μm)column，the mobile phase was acetonitrile-0.1%TFA solution(25:75) with the velocity of 1 mL/min and the column temperature of 30 ℃，the detection wavelength was set at 290 nm.And the injection volume was 20 μL.ResultsThe good linearity of protopine under chromatography was found of 14.2-142 μg/mL (r=0.9999,n=9),The average recovery rate was 104.5% with RSD of 2.47%,Both intra- and inter-day precision RSD were less than 1%(n=5).The samples were stable in 24 h.ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,it can be used for the quality control of protopine in rhizoma corydalis decumbentis eye drops.

rhizoma corydalis decumbentis eye drops; protopine; HPLC; content determination

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.58

溫州市公益性科技計劃(Y20150372)

蔡永豪，男，本科，主管藥師，研究方向：眼用藥物制劑研究，E-mail：cyh@mail.eye.ac.cn；郁引飛，通信作者，男，本科，主任藥師，研究方向：眼用藥物制劑研究，E-mail：wz88068866@163.com。

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