心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體MAO、COX活性的影響

陳嘉興，佟彤，楊志海，陳忻Δ

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 心血管科，北京 10010；2.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體MAO、COX活性的影響

陳嘉興1，佟彤1，楊志海2，陳忻2Δ

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 心血管科，北京 10010；2.首都醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

目的 通過(guò)大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)，探討心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞線粒體功能的影響。方法 培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，應(yīng)用血管緊張素II(AngII)造模，采用ELISA法檢測(cè)心肌細(xì)胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde,MDA)、單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)及環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)活性水平，反映線粒體功能及氧化應(yīng)激損傷情況；Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果 造模后，模型組心肌細(xì)胞SOD顯著降低，MDA上升，MAO活性升高，COX活性降低，caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)。含藥血清組及空白血清組SOD較模型組均有升高，MDA下降，但含藥血清組SOD較空白血清組升高，MAO活性降低，COX活性升高(P<0.05,P<0.01)；含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)caspase-3 mRNA含量與模型組相比顯著降低(P<0.01)。含藥血清組caspase-3 mRNA表達(dá)顯著低于空白血清組(P<0.01)。結(jié)論 心衰合劑含藥血清干預(yù)肥大心肌細(xì)胞可以顯著改善線粒體功能，減輕能量代謝損傷及氧化應(yīng)激損傷，并通過(guò)降低caspase-3的表達(dá)水平減輕細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。

心衰合劑；肥大心肌細(xì)胞；線粒體損傷

慢性心力衰竭的治療是當(dāng)前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，心肌細(xì)胞能量代謝障礙及心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭病理過(guò)程中的重要組成部分。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器,為產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所。研究顯示,線粒體功能障礙在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]，線粒體是防治心衰的重要靶點(diǎn)[2]，心衰合劑是由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院心血管科許心如教授結(jié)合中醫(yī)經(jīng)典理論和臨床實(shí)踐研制而得，既往研究顯示，心衰合劑具有改善心肌梗死后大鼠心功能，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等作用[3-5]。本研究通過(guò)心衰合劑含藥血清干預(yù)肥大心肌細(xì)胞，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，從線粒體心肌能量代謝的角度，探討心衰合劑治療心力衰竭的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠40只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(200±20)g，6～8 w；新生1～3 d SD大鼠30只，雌雄不限。以上大鼠均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 藥物:心衰合劑：黃芪30 g，太子參30 g，葶藶子15 g，桑白皮15 g，車(chē)前子10 g，赤芍10 g，水紅花子10 g。由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。按照臨床等效劑量換算，用蒸餾水配置成0.825 g/mL溶液備用。

1.1.3 試劑:1640培養(yǎng)基(GIBCO);胎牛血清(FBS,GIBCO); 血管緊張素II(AngII)、DMSO(Sigma); Ⅱ型膠原酶、PBS、MTT檢測(cè)試劑盒(銳爾康生物)；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(With ROX)、DNase Ⅰ、5×RNA Loading Buffer(CWbio.Co.Ltd)。

1.1.4 儀器:MultiSkan3酶標(biāo)儀(Thermo)；NANODROP 2000分光光度計(jì)(Therno scientific)；ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)；MCO-15AC型二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO)；XDS-2B型倒置顯微鏡(重慶光電)；SW-CJ-1D型超凈臺(tái)(江蘇通凈)；QL-902渦旋振蕩儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；Centrifuge 5415D離心機(jī)(Eppendorf)；Fresco低溫冷凍離心機(jī)(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備：Wistar鼠20只，隨機(jī)分為2組：給藥組灌胃給予心衰合劑0.825 g/mL，2 mL/100 g，空白組給予等量0.9%NaCl溶液；灌藥前禁食不禁水12 h，每天給藥2次(8 am，5 pm)，連續(xù)給藥5 d，最后一次給藥1～2 h后，0.4%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，無(wú)菌腹主動(dòng)脈取血(5～7 mL/只)，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，無(wú)菌條件分離血清；將每組血清混勻，56 ℃，30 min滅活，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 原代心肌細(xì)胞分離鑒定：取出生1～3 d的SD大鼠30只，消毒后開(kāi)胸取出心臟，立即放入預(yù)冷的PBS緩沖液中，吹打2次洗凈血液，棄PBS緩沖液；將心臟組織剪成5 mm×5 mm×5 mm大小，加入37 ℃預(yù)熱的0.1%的Ⅱ型膠原酶，加入量為心肌組織體積20倍，消化15 min，至組織塊粘連在一起，并伴有絮狀物質(zhì)。加入含10%胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)基，反復(fù)吹打組織至不粘稠，200目的細(xì)胞篩過(guò)濾收集得到細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將細(xì)胞重懸到含10%FBS的1640培養(yǎng)基中，加入至100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，自然沉降90 min，去除成纖維細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，接種到新的100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。5%CO2、37 ℃培養(yǎng)48 h后，更換新的完全培養(yǎng)基。

1.2.3 細(xì)胞造模及給藥方法：造模方案：對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，加入無(wú)血清培養(yǎng)基。模型組加入終濃度為1×10-6mol/L的AngII造模24 h。空白血清組加入10%空白血清培養(yǎng)24 h后，加入濃度為1×10-6mol/L的AngII造模24 h。含藥血清組：加入10%心衰合劑含藥血清培養(yǎng)24 h后，加入濃度為1×10-6mol/L的AngII造模24 h。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.2.4 SOD、MDA、MAO、COX檢測(cè)：將細(xì)胞沉淀按1×106個(gè)細(xì)胞：100 μL PBS比例重懸后，-20 ℃凍存過(guò)夜，隔天室溫復(fù)融；重復(fù)2～3次凍融后，10 000 r/min離心5 min，收集上清用于按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)：Caspase-3引物序列上游為:5’-ACTGGAAAGCCGAAACTCTTCATCA -3’；下游為:5’-GGAAGTC GGCCTCCACTGGTATC -3’；GAPDH引物序列上游為：5’-TGG AGTCTACTGGCGTCTT-3’，下游為:5’-TGTCATATTTCTCGTGGT TCA-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為127 bp。

提取細(xì)胞樣本總RNA并檢測(cè)RNA完成性，用DNase Ⅰ試劑盒對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)條件：95°10 min，(95 ℃15sec，60 ℃60sec)×45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞SOD、MDA的影響 經(jīng)過(guò)AngⅡ造模后，模型組心肌細(xì)胞SOD顯著降低，MDA升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。含藥血清組及空白血清組較模型組SOD均有升高，MDA下降，但含藥血清組SOD升高較空白血清組顯著(P<0.01)，2組間MDA未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)表1。

表1 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞SOD、MDA的影響

**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group；##P<0.01，與模型組比較，compared with model group；△△P<0.01，與空白血清組比較，compared with blank serum group

2.2 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞MAO、COX的影響 模型組細(xì)胞內(nèi)MAO活性升高(P<0.01)，線粒體COX活性降低(P<0.01)；含藥血清組及空白血清組較模型組相比，MAO活性降低，COX活性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。含藥血清組與空白血清組相比，其MAO活性顯著下降(P<0.01)，COX活性升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞MAO、COX的影響

**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group；##P<0.01，與模型組比較，compared with model group；△P<0.05，△△P<0.01，與空白血清組比較，compared with blank serum group

2.3 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)水平的影響 模型組心肌細(xì)胞caspase-3 mRNA較對(duì)照組表達(dá)顯著增加(P<0.01)。含藥血清組細(xì)胞caspase-3 mRNA含量顯著低于模型組(P<0.01)。含藥血清組caspase-3 mRNA表達(dá)顯著低于空白血清組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞caspase-3的影響

**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group；##P<0.01，與模型組比較，compared with model group；△△P<0.01，與空白血清組比較，compared with blank serum group

3 討論

心力衰竭是各種原因?qū)е碌男呐K功能下降，也是心血管病治療的最后戰(zhàn)場(chǎng)。當(dāng)各種原因?qū)е滦呐K壓力或容量負(fù)荷過(guò)重時(shí),心肌細(xì)胞無(wú)法維持正常的心輸出量以保證組織灌注，通過(guò)一系列的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)變化進(jìn)行代償，為了維持收縮壓和心臟壁厚度/心室半徑比之間的恒定，心肌細(xì)胞在神經(jīng)內(nèi)分泌各種因子的影響下發(fā)生肥厚。但這一改變使得線粒體必須一同增殖從而確保能量的供應(yīng)與消耗之間的平衡。線粒體的功能決定了其在能量代謝、氧化反應(yīng)、維持Ca2+穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞凋亡等方面的重要地位。當(dāng)心力衰竭發(fā)生時(shí)，線粒體通過(guò)多種方式應(yīng)對(duì)這一變化，以維持細(xì)胞存活，當(dāng)損傷持續(xù)加重?zé)o法緩解時(shí)，線粒體調(diào)節(jié)作用失代償，轉(zhuǎn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞色素C氧化酶(COX)及單胺氧化酶(MAO)廣泛存在于線粒體上,在能量產(chǎn)生中起主要作用[6]。COX活力下降可以導(dǎo)致細(xì)胞的ATP水平降低從而啟動(dòng)凋亡，COX活力改變同時(shí)可使線粒體內(nèi)跨膜電位崩潰，而該線粒體膜電位下降使膜電位通透轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，COX釋入胞漿啟動(dòng)Caspase系統(tǒng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。當(dāng)心臟應(yīng)激時(shí)，心肌組織中MA0可將兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)催化生成過(guò)氧化氫，是應(yīng)激時(shí)活性氧(R0S)的主要來(lái)源。而研究提示ROS能通過(guò)多種信號(hào)通路介導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)和細(xì)胞功能失調(diào)[8]。

慢性心力衰竭中醫(yī)常列入“心悸”、“喘證”、“水腫”等范疇。心肺同居于上焦，在生理上密切關(guān)聯(lián)，同時(shí)在病理上也互相影響。故心氣不足，則水飲內(nèi)停，阻于嬌臟，這是心衰病的重要病機(jī)。患者氣虛是本，水停為標(biāo)，根據(jù)病因病機(jī)，許心如教授上個(gè)世紀(jì)60年代在國(guó)內(nèi)首創(chuàng)“瀉肺利水法”，并以《金匱要略》葶藶大棗瀉肺湯和防己黃芪湯為主方研制心衰合劑。課題組既往多項(xiàng)臨床、基礎(chǔ)研究顯示，心衰合劑具有擴(kuò)張血管、利尿、正性肌力作用、調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌功能、防止細(xì)胞發(fā)生凋亡等作用[9-12]。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示，心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)AngII培養(yǎng)后出現(xiàn)了線粒體功能上的損害以及能量代謝的異常。模型組細(xì)胞MAO上調(diào)、COX下降，并出現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)，伴隨COX的活力改變，caspase-3表達(dá)含量顯著增加，致使心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。通過(guò)心衰合劑含藥血清可以降低MAO水平，并上調(diào)COX活性，減輕心肌細(xì)胞線粒體功能損傷，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝，抑制ROS的生成，并降低caspase-3的表達(dá)水平從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

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(編校：王儼儼)

作 者 簡(jiǎn) 介

陳忻教授，1997～2000年任北京聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室主任，2000～2001年進(jìn)入日本新澙藥科大學(xué)放射化學(xué)教研室交流，2002年起進(jìn)入首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院從事中藥藥理教學(xué)與相關(guān)研究,2006～2015擔(dān)任系主任。

陳忻教授從事藥理、中藥藥理的教學(xué)及科研30余年，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中藥實(shí)驗(yàn)藥理分會(huì)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)委員，北京自然科學(xué)基金、國(guó)家科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)評(píng)審專(zhuān)家，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)會(huì)員。近5年主持北京市教育委員會(huì)面上項(xiàng)目2項(xiàng)，研究方向主要為中藥對(duì)帕金森病神經(jīng)保護(hù)作用的基礎(chǔ)研究，在魚(yú)藤酮帕金森病模型研究以及黃芩苷等中藥有效成分保護(hù)多巴胺神經(jīng)及作用機(jī)制研究上取得進(jìn)展。國(guó)內(nèi)外刊物第一作者或責(zé)任作者發(fā)表論文近60余篇(SCI收錄9篇)。主持首都醫(yī)科大學(xué)科技基金及教改課題3項(xiàng)；在高等醫(yī)學(xué)教育、中藥學(xué)學(xué)科建設(shè)和教學(xué)改革上頗有見(jiàn)解，并有多篇教改論文發(fā)表，近年主持多項(xiàng)校級(jí)中藥專(zhuān)業(yè)研究生培養(yǎng)和中藥本科專(zhuān)業(yè)建設(shè)質(zhì)量工程項(xiàng)目。參加編寫(xiě)國(guó)家十一五、十二五規(guī)劃教材《藥理學(xué)》《中藥藥理學(xué)》《臨床藥學(xué)》等共7本，配套教材3本，專(zhuān)著2部，主編自編教材2本。

Effect of Xinshuai mixture on MAO and COX activity in hypertrophy myocardial cell

CHEN Jia-xing1, TONG Tong1, YANG Zhi-hai2, CHEN Xin2Δ

(1.Department of Cardiology, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100010, China; 2.School of Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo study the effects of Xinshuai mixture on mitochondrial function of hypertrophy cardiomyocyte cellinvitro.MethodsThe primary neonatal rat myocardial cells were cultured to establish hypertrophic myocardial model by AngII.The levels of superoxide dismutase(SOD), methane dicarboxylic aldehyde (MDA), monoamine oxidase(MAO) and cyclooxygenase (COX) were detected by ELISA, as the mitochondrial function and oxidative stress damage.The expression level of caspase-3 mRNA was detected by Real-time PCR.ResultsCompared with control group, the SOD level in model group reduced markedly, MDA level increased significantly, the activities of MAO increased, the activities of COX decreased, the expression of caspase-3 level increased significantly(P<0.01).Compared with the model group, the SOD level increased and MDA level decreased in Xinshuai mixture group and blank serum group.But the SOD level and activities of MAO, COX in Xinshuai mixture group and blank serum group had significant difference(P<0.05,P<0.01).The expression of caspase-3 mRNA level in Xinshuai mixture was significantly higher than the blank serum group(P<0.01).ConclusionXinshuai mixture could significantly improve the fuction of mitochondrial in hypertrophy cardiomyocyte cell, reduce the energy metabolism and oxidative stress injury, and protect cardiac myocyte through lower the expression of caspase-3.

Xinshuai mixture; hypertrophy cardiomyocyte cell; mitochondria damage

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.005

首都醫(yī)科大學(xué)2014年基礎(chǔ)臨床科研合作基金課題(14JL82)；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)課題育苗計(jì)劃(2014YM-14)

陳嘉興，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合心血管病，E-mail：cjx710704@sina.com；陳忻，通信作者，女，教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：chenxin4283@126.com。

R541.6+1；R285.5

A