膠原基納米骨材料（nHAC）體內降解的實驗研究

戴昕

[摘要] 目的 探討膠原基納米骨材料（nHAC）在頜骨組織內的降解速率和骨修復作用，評價其生物學性能，為將此材料引入頜骨缺損修復中提供實驗依據。 方法 18只SD大鼠于下頜骨內制備骨缺損，隨機選取一側放入nHAC（實驗組），另一側為空白對照組。術后分別于第4、8、16周處死6只取樣，觀察材料的降解與骨缺損修復情況。 結果 8周時植入頜骨內的材料的體積外形均出現明顯變化，16周時材料體積進一步減小，骨腔進一步縮小，但未完全愈合。組織學觀察顯示：植入nHAC的實驗組8周時出現明顯降解，材料空隙內有血管及新生骨組織長入，至16周時有新生骨小梁長入材料降解后所形成的空隙之中；空白對照組無明顯骨修復。 結論 nHAC有助于骨缺損的修復，在觀察期內材料可降解，材料降解后為新生骨組織所替代。

[關鍵詞] 膠原基納米骨材料；生物相容性；體內降解；骨再生

[中圖分類號] R783 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（a）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the degradation rate and bone repair effect of collagen nano bone material （nHAC） and evaluate its biological performance to provide experiment basis for the clinical application of nHAC in jaw defect reconstruction. Methods 18 SD mice were produced bone defects in lower jaw and were randomly selected one sideway into nHAC，the other sideway into control group.After operation，6 mice were respectively executed at 4，8，16 weeks.The degradation of material and repair situation of bone defect were observed. Results The volume and shape of implant materials in the jaw appeared obvious changes at 8 weeks and the volume and bone cavity further decreased at 16 weeks，but not completely healed.Histological observation： implantation nHAC group appeared obvious degradation at 8 weeks.Vascular and new bone tissue grew into material gap，and newly formed trabeculae grew into gap that informed after material degradation at 16 weeks.There were no obvious repair in control group. Conclusion This study has confirmed that nHAC is good for repair of bone repair.The material can degrade during observation term and can be replaced by new bone tissue.

[Key words] nHAC；Biocompatible；Degrade in the body；Bone regeneration

飛速發展的組織工程學通過構建出具有良好生物功能的組織替代物，并將其廣泛用于修復和重建受損組織，恢復和改善機體功能中。骨組織工程學普遍使用支架扮演模板的角色，因此恰當地設計人工骨支架，使其立體結構類似人類骨質的三維結構，有利于細胞在其上粘附生長。目前，可生物降解的支架材料由于其能在體內生物降解，且產物無毒已被廣泛應用于組織工程支架材料的研究。骨組織工程支架材料的生物學行為是影響其臨床應用的主要因素，材料的孔徑形狀、大小、孔隙率及其組成成分均可影響其生物降解性與骨傳導性。本實驗采用體內植入、自體雙側比較的實驗方法對膠原基納米骨植入材料（nHAC）進行初步評價，結果顯示此種人工骨材料具有骨修復效果與生物降解特性，為今后進一步的研究提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要材料和儀器 10%水合氯醛（昆山市石浦年沙助劑廠，批號：H32022265），2%利多卡因（太極西南藥業股份有限公司，批號：H50020308），青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠，批號：H23021438），生理鹽水，中性福爾馬林溶液，聚維酮碘液（杭州民生藥業公司，批號：H33021572），手術外科器械盒，一次性無菌注射器、清創包、無菌敷料。

1.1.2 實驗動物 成年SD（Sprague-Dawley）大鼠18只，許可證號：SYXK（川）2013-119，雌雄不限，體重230～300 g，由四川大學實驗動物中心提供。適應性飼養1周。

1.1.3 實驗材料 選擇1 mm×1 mm×1 mm大小的正方體nHAC（紫外線消毒30 min）。

1.2 方法

腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，取仰臥位，將其固定于手術臺上，下頜區備皮。局部注射適量2%利多卡因后，切開雙側下頜骨下緣皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜，暴露下頜骨，用牙科低速手機在下頜頜骨兩側各制備1.5 mm×1.5 mm的長方形全層骨缺損，生理鹽水沖洗缺損區，無菌棉球吸干，將實驗用nHAC放入缺損區，空白對照組不作處理，咬肌復位到下頜骨，縫合外切口。

1.3 取材與觀察

術后觀察動物創口愈合情況。4、8、16周后將實驗組大鼠處斷頭處死6只，截取雙下頜骨，通過大體標本觀察，并進行HE染色，觀察骨形成與植入材料降解的情況。

2 結果

2.1實驗動物的一般情況

各動物均術后4 h內清醒，有2只感染，被排除實驗，后又補了2只。所有動物創口均愈合良好，無移植物排斥反應。

2.2 實驗動物的大體觀察

實驗組動物4周時骨缺損區無明顯縮小，可見植入的nHAC外形清晰，體積無明顯變化（圖1）；8周時各骨缺損區有所減小，缺損區中央部分由增生的結締組織充填，邊緣有骨質增生，仍可見nHAC材料，但外形已經發生改變（圖2）；16周時骨缺損修復區面積縮小明顯，骨缺損區已有明顯愈合，植入的nHAC材料邊緣與周邊骨質有骨融合，與標準材料相比，植入骨內的材料降解明顯，體積減小且邊界不清（圖3）。空白對照組16周時骨腔雖有縮小，但與實驗組差距明顯，且未出現明顯的骨組織修復，僅由纖維組織充填（圖4）。圖中箭頭處均為nHAC材料顯示。

2.3 組織學觀察

實驗組8周時nHAC中有血管及軟組織長入，可見多核巨噬細胞浸潤，材料開始降解（圖5）；16周時可見材料部分降解后形成的空隙，有較多新生骨小梁形成并長入nHAC降解的空隙之中（圖6）。空白對照組骨缺損處無明顯成骨，未出現明顯骨組織修復，而是由纖維組織充填（圖7）。

3 討論

頜骨與牙槽骨缺損的治療是口腔科的難題之一[1]。常用的治療方法是自體或異體骨移植術，自體骨常取髂骨塊、肋骨等，異體骨則取凍干骨段。但兩種骨移植術各有其局限性，自體骨移植成骨活性好，但取骨量十分有限，不能滿足臨床需求，且對供骨區造成明顯損傷；異體骨移植則存在成骨活性差、容易傳播疾病等問題。隨著骨組織工程研究的不斷發展，人工骨應用于骨缺損修復的價值逐漸被人重視，理想的人工骨材料應該能逐漸降解并被新生骨所替代[2]。有研究表明，納米級羥基磷灰石因晶體尺度與天然骨接近[3]，具有良好的理化及生物學性能[4]，但單一的羥基磷灰石機械性差，作為骨替代材料可靠性不高[5]，且在體液中很難吸收，從而限制了它的應用[6]。膠原為天然大分子物質，為結締組織的主要成分，是制備骨組織工程材料的理想成分。nHAC由于這種材料是以去抗原的Ⅰ型膠原為支架，將礦物相為晶體尺寸納米量級的羥基磷灰石與之復合，復合過程中將材料學與生物學特性相結合[7]，從微觀結構上仿造天然骨，有很高的比表面積及足夠的孔徑、孔隙率[8]，這有助于骨系細胞的粘附、增殖及功能的發揮[9]，并且利于骨組織長入[10]，便于生物降解[11]。因此運用這種最為常用有效的檢測方法——體內埋植實驗對nHAC進行測試，可針對性地了解nHAC在骨腔中的生物學行為[12]。

本實驗采用大鼠自體雙側下頜骨對照方法，盡管大鼠骨骼尺寸較小，但仍可進行鉆孔、截斷及內、外固定等操作，較適合骨缺損的研究[13]。隨機選取一側作為實驗組，采用nHAC修復，另一側作為空白對照組。在SD大鼠下頜骨上造成1.5 mm×1.5 mm以上的貫穿性骨缺損，符合骨移植的適應證[14]。實驗結果證實了該材料具有良好的骨傳導性與骨組織相容性。從大體標本觀察：實驗組16周時骨缺損植入區界限模糊，并伴大量骨痂形成；空白對照組骨缺損植入區界限清晰，周圍少量骨痂形成，因為單純材料植入時骨缺損修復依靠周圍纖維結締組織及血管的長入，而材料所具有的骨傳導性能，可提供支架，使斷端的骨以爬行替代的方式向缺損中心處生長。組織學觀察：實驗組8周時nHAC中有軟組織與血管長入，并可見巨噬細胞浸潤、吞噬植入材料，但未見炎癥反應，說明材料已開始降解；16周時nHAC降解已較明顯，可見較多新生骨小梁長入nHAC降解的空隙之中，因此該材料的體內降解是一個漸進過程，具備骨傳導能力，一定程度上能促進骨腔愈合。研究表明，nHAC是一種較為理想的骨缺損修復材料，此種材料也為今后骨組織工程材料的發展與臨床骨缺損的修復提供了一些新的思路[15]。

本實驗結果也表明，由于使用的nHAC材料有一定的力學強度，降解較慢，所以到16周時骨缺損仍未完全愈合，故進一步完善nHAC材料的制備工藝，研制出在早期力學強度好，后期快速降解完全的材料則更能夠滿足修復頜面部骨缺損的要求。

[參考文獻]

[1] Iikura T，Lee SY，Sakai Y，et al.Causative factors of fracture nonunion：the proportions of mechanical，biological，patient-dependent，and patient-independent factors[J].J Orthop Sci，2014，19（1）：120-124.

[2] Giannoudis PV，Dinopoulos H，Tsiridis E.Bone substitutes：an update[J].Injury，2008，36（S1）：S20-S27.

[3] Hartgerink JD，Beniash E，Stupp SL.Self-assembly and mineralization of peptide-amphiphile nanofibers[J].Science，2001，294（5547）：1684-1688.

[4] 汪安，陳建榮，張磊，等.生物吸收性多孔磷酸化羥基磷灰石支架的骨傳導性體外研究[J].口腔頜面外科學雜志，2014，24（3）：185-191.

[5] Cancedda R，Giannoni P，Mastrogiacomo M.A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice[J].Biomaterials，2007，28（29）：4240-4250.

[6] 孫慶治.納米羥基磷灰石/絲素蛋白人工骨修復骨缺損[J].中國組織工程研究，2015，19（8）：1190-1194.

[7] 袁媛，劉昌勝.溶膠-凝膠法制備納米羥基磷灰石[J].中國醫學科學院學報，2002，24（2）：129-133.

[8] 陳曉峰，李玉莉，趙娜如.溶膠-凝膠生物活性玻璃納米結構分析研究[J].硅酸鹽通報，2009，26（2）：247-251.

[9] 胡龍，趙暢，徐雷.結構仿生羥基磷灰石多孔陶瓷的制備及其性能研究[J].生物骨科材料與臨床研究，2011，8（4）：4-7.

[10] Kaya M，Simsek—Kaya G，GǔrsanN，et al.Local treatment of chronic osteomyelitis with surgical debridement and tigecycline-impregnated calcium hydroxyapatite：an experimental study[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radial，2012，106（3）：340-347.

[11] 廖素三，崔福齋，張偉.組織工程中膠原基納米骨復合材料的研制[J].中國醫學科學院學報，2003，25（1）：36-38.

[12] Moretti Neto RT，Mello I，Moretti AB，et al.In vivo qualitative analysis of the biocompatibility of different cyanoacrylate-based adhesives[J].Braz Oral Res，2008，22（1）：43-47.

[13] Stahli C，Bohner M，Bashoor-Zadeh M，et al.Aqueous impregnation of porous 13-triealeium phosphate scaffolds[J].Acta Biomater，2010，6（7）：2760-2772.

[14] RimondiniL，Nicoli-Aldini N，Fini M，et al.In vivo experimental study on bone regeneration in critical bone defects using an injectable biodegrable PLA/PGA copolymer[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2005，99（2）：148-154.

[15] 杜娟，王佃亮，張艷梅，等.組織工程面臨的技術挑戰與發展趨勢 [J].中國生物工程雜志，2011，31（6）：142-148.

（收稿日期：2015-12-09 本文編輯：衛 軻）