基于454高通量測序平臺血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測

韓 娜強裕俊張婷婷苗嬌嬌張 雯*（1 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協同創新中心，浙江 杭州 310003）

?

基于454高通量測序平臺血液、呼吸道、消化道臨床樣本的快速檢測

韓 娜1，2強裕俊1，2張婷婷1，2苗嬌嬌1，2張 雯1，2*
（1 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所生物信息室，北京 102206；2 感染性疾病診治協同創新中心，浙江 杭州 310003）

【摘要】目的 探討454高通量測序平臺應用于臨床樣本快速檢測的可能性。方法 應用454高通量測序平臺測定血液、呼吸道和消化道臨床樣本中微生物菌群的16S rDNA基因的V3-V4高變異區段序列，采用BLAST方法與RDP數據庫進行比對，基于比對結果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數。結果 8份臨床模擬樣本中，7份檢測出目標菌屬，檢出率為87.5%。在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態下的無菌體液，檢測結果較為明確，檢出的細菌較為集中，顯示了檢測結果的可靠性。而對本身含有較多種類細菌的糞便樣本，其目標菌比例明顯降低。結論 實現了80 h內得到血液、呼吸道和消化道臨床樣本中含有病原菌情況的檢測報告，并探討了高通量測序技術在今后臨床實際應用時進一步提高檢測速度和靈敏度的方法。

【關鍵詞】454高通量測序；臨床樣本；病原菌；檢測

16S rRNA位于原核細胞核糖體小亞基上，包括10個保守區域（conversed regions）和9個高變區域（hypervariable regions），其中保守區在細菌間差異不大，高變區具有屬或種的特異性，隨親緣關系不同而有一定的差異［1］。因此，16S rRNA可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統發育和分類鑒定的指標［2］。然而16SrRNA的檢測前提是需要病原的分離培養。雖然人們已通過實驗室培養分離并保存了部分穩定的菌株，但實際上目前僅有上千種（Species水平）的微生物基因組獲得了成功測序；99%的環境微生物，尤其以厭氧和極端環境生存菌，仍無法分離純化而實現實驗室培養或尚未成功建立培養體系［3］。由于技術有限性導致對大量微生物表型、遺傳信息的認知局限性，大大限制了我們對這些未知菌種的研發和利用，也限制了我們進一步解析微生物和人類健康間的關聯性。

近年來隨著高通量測序平臺和技術的不斷革新，宏基因組研究，不依賴于培養技術，以整個微生物群落遺傳物質為研究對象，大力推動了整個微生物群落的結構和功能基因組學研究的迅速發展，促使人們不斷深入了解這些微生物群落的結構、功能、進化以及群落間，群落與環境間的相互作用關系，以及微生物和人類健康間的關聯性［4-5］。本課題組在前期的工作中，也利用宏基因組學方法（16S Meta）探索了人類腸道的菌群結構變化和兒童腹瀉、糖尿病等多種疾病之間的關聯性［6-7］。然而目前仍缺乏基于16s rDNA的未知病原菌高通量篩查技術，如何利用宏基因組技術從患者身上快速檢測出病原菌仍是傳染病工作目前發展的技術難題。在本研究中，本課題組利用454測序平臺，對血液、呼吸道和消化道的臨床模擬樣本進行了16S rDNA宏基因組測序，基于測序結果進行了未知病原檢測，實現了80 h內完成8份模擬臨床樣本的檢測，對探索高通量測序方法在臨床檢測方面的應用做出了一定的貢獻。

1 資料與方法

1.1 樣本準備：收集8份健康人的樣本，分別為灌洗液、咽拭子、血液和糞便，分別添加8種不同的病原菌（表1），濃度為～104ccfu/g。

1.2 核酸提取：8份模擬樣本的核酸提取是利用Qiagen UCP Pathogen Mini Kit試劑盒。提取方法詳細如下：加40 μL Proteinase K，渦旋器混合樣本10 s；56 ℃孵化10 min；加200 μL Buffer APL2到樣本，蓋上蓋子，多脈沖渦旋器震蕩混合30 s；70 ℃孵化10 min；瞬時離心，將蓋子上的液體滴落；加300 μL乙醇到裂解液中，蓋上蓋子，多脈沖震蕩漩渦器震蕩15～30 s混合均勻；加混合物到QIAamp UCP Mini spin column柱子上，6000×g（8000 rpm）離心1 min；小心打開離心柱，加600 μL Buffer APW1，避免污染柱子邊緣，6000×g（8000 rpm）離心1 min；加750 mL Buffer APW2，全速（20000×g，14000 rpm）離心3 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，棄置含廢液的收集管。全速離心1 min；將離心柱放置到新的2 mL收集管中，打開蓋子，56 ℃孵化整個裝置3 min，將膜徹底干燥；將離心柱放置到新的1.5 mL洗脫管中，棄置收集管，小心加20～100 μL Buffer AVE到離心柱的中央。蓋上蓋子，室溫靜止1 min；全速離心（20000×g，14000 rpm）1 min，洗脫DNA。

表1 8份模擬樣本的詳細信息。

1.3 高通量測序：基于454測序平臺進行測序，按照454 Junior測序平臺標準操作手冊進行。工作流程見圖1。

1.4 數據分析：測序序結果，利用FastQC進行質量控制。剔除低質量序列后，我們采用BLAST方法與RDP數據庫進行比對，基于比對結果，獲得不同種屬的病原菌的所匹配的read數。

2 結 果

2015年10月13日9：00實驗室取樣，依次進行核酸提取、16S擴增、建庫、油包水實驗、測序和數據分析步驟（如圖1所示），于10月16日17：35生成鑒定報告，總工作時間80 h。所需人力3名，其中實驗室人員2名，數據分析人員1名。

樣本一為肺泡灌洗液模擬樣本，測序序列數（read）為773。經過與RDP數據庫比對，有458條序列與軍團菌屬匹配，比例為59.64%。通過與16S數據庫比對，有348條序列與目標菌嗜肺軍團菌匹配，比例為45.44%。檢測結果為陽性。

表2 8份臨床模擬樣本的檢測結果

圖1 工作流程及時間

樣本二為咽拭子模擬樣本，測序序列數（read）為10376。經過與RDP數據庫比對，有9725條序列與不動桿菌屬匹配，比例為94.07%。通過與16S數據庫比對，有348條序列與目標菌不動桿菌屬匹配，比例為42.88%。檢測結果屬水平上為陽性。

樣本三為血液模擬樣本，測序序列數（read）為1279。經過與RDP數據庫比對，有1006條序列與李斯特菌屬匹配，比例為78.66%。通過與16S數據庫比對，有915條序列與目標菌李斯特菌屬匹配，比例為71.54%。檢測結果屬水平上為陽性。

樣本四為糞便模擬樣本，測序序列數（read）為3262。經過與RDP數據庫和16S數據庫比對，皆無序列與空腸彎曲菌匹配。檢測結果為陰性。

樣本五為糞便模擬樣本，測序序列數（read）為7375。經過與RDP數據庫比對，有1425條序列與弧菌屬匹配，比例為19.42%。通過與16S數據庫比對，有384條序列與目標菌副溶血弧菌匹配，比例為5.23%。檢測結果為陽性。

樣本六為糞便模擬樣本，測序序列數（read）為7464。經過與RDP數據庫比對，有81條序列與弧菌屬匹配，比例為1.09%。通過與16S數據庫比對，有4條序列與目標菌弧菌屬匹配，比例為0.06%。檢測結果屬水平上為陽性。

樣本七為糞便模擬樣本，測序序列數（read）為425。經過與RDP數據庫比對，有150條序列與沙門菌屬匹配，比例為36.08%。通過與16S數據庫比對，有107條序列與目標菌腸道沙門菌匹配，比例為25.18%。檢測結果為陽性。

樣本八為糞便模擬樣本，測序序列數（read）為1484。經過與RDP數據庫比對，有1條序列與氣單胞菌屬匹配，比例為0.07%。通過與16S數據庫比對，有2條序列與目標菌嗜水氣單胞菌匹配，比例為0.13%。檢測結果為陽性。

8份臨床模擬樣本中，7份檢測出目標菌屬，檢出率為87.5%。詳細檢測結果請見表2。

3 討 論

目前臨床上，常規培養、生化血清學鑒定方法仍是主流的檢測方法，但存在檢出率低和漏檢率高的缺點?；谔禺愋蛄械腜CR方法靈敏度高、檢測速度快，但只能針對一種或幾種特定的菌進行鑒定，不利于用于未知病原的篩查。高通量測序檢測方法由于其數據量大，不依賴于細菌培養，一經面世就被寄予了解決未知病原檢測問題的厚望，本研究模擬臨床實戰，從樣本接受到返回報告，實現了80 h內的得到檢測報告，檢出率高達87.5%，具有較高的敏感性。然而目前的實驗的樣本數還較少，其敏感性和特異性還需要大數據量的進一步的驗證。此外，本次實驗也反映出了一些問題。

首先，檢測時間需要80 h，從臨床應急的角度仍需進一步的壓縮。為解決以上問題，我們計劃采取硬件和軟件一起優化的策略。在硬件上，升級測序平臺，改用測序時間更短的新一代測序儀；在軟件上，實現人員的合理配置，從現在的單班8小時工作優化為雙組輪班制，以最大可能的壓縮閑置時間。

其次，目前的檢測結果顯示在血液、肺泡灌洗液和咽拭子這類正常狀態下的無菌體液，檢測結果較為明確，檢出的細菌較為集中，目標菌比例超過50%，最高超過94%，顯示了檢測結果的可靠性。而對本身含有較多種類細菌的糞便樣本，其目標菌比例明顯降低。這提示了我們未來在對有菌體液，如糞便樣本的檢測中，需要提高測序數據量，以盡可能覆蓋目標菌群，提高檢測的陽性率。

最后，目前的檢測結果仍局限于屬水平上，在種水平上由于目前的16S數據庫數據量較小的原因，很多病原菌在種水平上不能檢出。因此，我們需要針對常見的病原菌擴增16S全長，補充到我們目前的數據庫中，以提高檢測精確度。

綜上所述，454高通量測序平臺可用于臨床樣本的快速檢測，且

中圖分類號：R446

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）17-0039-03

基金項目：國家自然科學基金青年基金（課題編號81201322）和國家高技術研究發展計劃課題（2014AA021505）

*通訊作者：E-mail：Zhangwen@icdc.cn