白頭翁湯通過保護微血管內皮細胞的完整性及PMNs遷移殺菌功能的影響

王明明，楊　舒，董　虹，穆　祥

(北京農學院 獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

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白頭翁湯通過保護微血管內皮細胞的完整性及PMNs遷移殺菌功能的影響

王明明，楊舒，董虹*，穆祥*

(北京農學院 獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

摘要：本研究旨在研究白頭翁湯(PD)對脂多糖(LPS)誘導內皮細胞損傷的保護作用，從而揭示白頭翁湯的藥理作用。分別采用水溶性四氮唑(WST-1)、乳酸脫氫酶(LDH)、蘇木素伊紅(HE)和Hoechst33342染色法檢測PD和LPS對大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(RIMVECs)增殖、細胞毒性、細胞連接和細胞核變化的影響；建立中性粒細胞(PMNs)跨RIMVECs遷移的Transwel模型，檢測PD對LPS損傷的RIMVECs后PMNs細胞內和細胞外細菌數量的影響。結果顯示，LPS(1 μg·mL-1)致RIMVECs細胞核萎縮、細胞膜損壞，細胞毒性百分比達53.2%；細胞連接破壞導致細胞脫落，脫落率為39.6%。PD(20 μg·mL-1)對上述損傷有明顯的保護作用。在20 μg·mL-1PD作用下，LPS誘導的跨內皮遷移的PMNs細胞內外細菌的存活明顯減少(P<0.01)。結果揭示PD可以有效保護LPS損傷的RIMVECs從而增強PMNs的殺菌能力，為臨床治療動物細菌性疾病用藥提供理論依據。

關鍵詞：白頭翁湯；大鼠腸黏膜微血管內皮細胞；脂多糖；中性粒細胞

微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MVECs)作為裱襯于血管內部的一層扁平細胞[1]，最初被認為只是一種屏障細胞，但隨著近年來研究的深入，發現它是各種致病因子的靶點細胞和效應細胞[2]。內皮細胞(endothelial cell，ECs)的完整性對于機體發揮固有免疫具有至關重要的作用。內毒素(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌裂解出來的細胞壁脂多糖，釋放到介質中攻擊機體免疫屏障。中性粒細胞(polymorph nuclear neutrophils，PMNs)作為固有免疫執行者需要跨越內皮細胞才能達到病灶組織，從而發揮其抗菌作用[3]。因此，對內皮細胞的保護作用是提高免疫調節的途徑之一。

目前中藥復方有效保護內皮細胞的報道甚多[4-6]，但是保護和提高機體免疫機能的方式有待進一步研究。白頭翁湯(Pulsatillae decoction，PD)出自張仲景的《傷寒論》，是經典的清熱涼血中藥復方[7]。近年來，研究發現白頭翁湯具有抗菌消炎、愈合結節性潰瘍以及促進免疫調節等現代藥用價值[8-9]。作為天然中草藥組成的復方，低毒性、低殘留、低抗藥性的特點使其擁有深入研究的意義。

本試驗以PD為契機，在細胞水平上深入研究PD的藥理作用，通過體外培養的大鼠腸黏膜微血管內皮細胞(rat microvascular endothelial cells，RIMVECs)，建立LPS誘導的細胞損傷模型，檢測LPS及PD對RIMVECs細胞增殖、毒性及形態變化的影響，并考察PD對跨內皮遷移的PMNs細胞內外殺菌情況的影響，為進一步研究PD治療細菌性疾病提供理論依據。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

多功能酶標儀(BIOTEK，型號SYNERGY4)；CO2恒溫培養箱(SANYO，型號MCO-17AC)；奧林巴斯研究顯微鏡(OLYMPUS，型號IX71)；Transwell 通透性支持物(Corning，批號：3421)等。WST-1細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(碧云天，批號：C0035)；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(碧云天，批號C0017)；蘇木素伊紅染色試劑盒(碧云天，批號C0105)；LPS(SIGMA，批號L2880)；Hoechst 33342(SIGMA，批號B2261)；Cell Proliferation Reagent(Roche，批號：11644807001)；Percoll (GE Healthcare公司，批號：170891-01-100mL)；葡聚糖Dextran T500(Pharmacia公司，批號17032001)；大腸桿菌標準株O101(CVCC1525，購自中國獸醫藥品監察所)；白頭翁、黃連、黃柏、秦皮購自北京同仁堂藥店。

1.2試驗材料

將本實驗室凍存的第11代RIMVECs復蘇后傳代，試驗所用為13～14代。本試驗將白頭翁150 g、黃連60 g、黃柏120 g、秦皮120 g參照獸藥典制備白頭翁湯水煎劑，濃縮成生藥濃度為1 g·mL-1，滅菌處理后4 ℃冰箱保存[10]。本試驗應用Image J軟件分析熒光強度及細胞脫落率。

1.3細胞形態學觀察

為了觀察LPS對微血管內皮細胞的損傷及PD對其保護情況，本試驗通過HE、Hoechst33342染色觀察細胞形態及細胞核的變化。將RIMVECs以1×105·mL-1密度接種于24孔板并按照表1進行細胞分組處理，細胞分為對照組、PD組、LPS組、預防組、治療組。其中對照組為含有2%胎牛血清的DMEM。

試驗中HE染色嚴格按照試劑盒說明書進行，通過Image J軟件及計數培養基中脫落細胞數并計算細胞脫落率。試驗所用Hoechst33342的終質量濃度為10 μg·mL-1，室溫避光染色20 min，PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察，并通過Image J軟件分析細胞平均光密度。

1.4細胞增殖率及細胞毒性的檢測

分別利用WST-1和LDH法檢測PD和LPS對RIMVECs增殖、細胞毒性及細胞膜完整性進行評價。RIMVECs生長至70%～80%匯合狀態，以1×105·mL-1的密度接種于96孔細胞培養板。將細胞分為對照組、PD組、LPS組、預防組、治療組，并按照表1進行細胞處理，每組重復三次。

表1細胞分組與處理

Table 1Cell groups and treaments

分組Group預處理Pre-treatment處理Treatment處理時間/hHours對照組等體積培養基等體積的培養基24PD組等體積培養基PD(0.2、2、20、200μg·mL-1)24LPS組等體積培養基LPS(0.1、1、10、100μg·mL-1)24預防組PD:20μg·mL-1LPS(0.1、1、10、100μg·mL-1)24治療組LPS:1μg·mL-1PD(0.2、2、20、200μg·mL-1)24

嚴格按照WST-1細胞增殖與細胞毒性檢測試劑盒說明書，在450 nm波長處測定吸光度。通過公式計算細胞增殖率：增殖率=(樣品組-空白對照)/(對照組-空白對照)×100%，其中空白對照為無細胞的培養基。嚴格按照LDH檢測試劑盒說明書，在450 nm波長處測定吸光度。通過公式計算：細胞毒性百分比=(處理樣品吸光度-樣品對照孔吸光度)/(最大酶活性吸光度-樣品對照孔吸光度)×100%。

1.5Transwell體系的建立

利用Transwell通透性支持物，建立跨RIMVECs的PMN遷移Transwell體系。取生長匯合的RIMVECs(3×104·mL-1·well-1)接種于膜孔徑為5.0 μm的Transwell小室中，并在下室加入600 μL 2%DMEM，37 ℃的5%CO2培養箱中培養至單層匯合狀態。利用Millicell ERS-2系統檢測Transwell小室中內皮細胞電阻，通過公式計算：區域面積電阻值(Ω·cm2)= 電阻值×Transwell小室膜面積，確定細胞培養至單層匯合狀態。將細胞分為對照組、PD組、LPS組、預防組、治療組，按照表1進行試劑處理，處理時間為4 h。在小室中加入利用葡聚糖及Percoll梯度離心分離，并用臺盼藍染色調整懸液密度為1×106·mL-1的PMNs，放入37 ℃的5%CO2中靜置培養4 h。

1.6跨內皮遷移的中性粒細胞殺菌功能檢測[11-12]

慶大霉素保護試驗按照文獻描述進行。將生長至對數期的大腸桿菌菌株用PBS洗滌并在培養液中重懸，37 ℃培養30 min備用。“1.5”中各組孵育完成后在下室中加入10 μL大腸桿菌(1×103·mL-1)繼續培養3 h。收集下室中的培養基并用PBS稀釋，取100 μL涂于麥康凱瓊脂平板檢測細胞外活菌數。加入300 μg·mL-1慶大霉素作用20 min殺死胞外菌，破碎PMNs后取100 μL涂于麥康凱瓊脂平板檢測細胞內活菌數，37 ℃孵育過夜。

1.7數據處理與分析

試驗結果用Graphpad Prism 6統計軟件處理數據，所有數據采用均數±標準差表示。*P<0.05、**P<0.01為差異有統計學意義。

2結果

2.1PD及LPS對細胞形態的影響

通過HE染色觀察內皮細胞連接的變化，結果發現PD組細胞增多，細胞脫落率呈負值。LPS組細胞形態出現拉伸等狀態(如圖1C箭頭所指)并出現大批量的細胞脫落，脫落率達到39.6%。預防組與治療組細胞脫落顯著低于LPS組(P<0.05，圖1)。

細胞損傷時，細胞核或者細胞質內可見濃染致密的顆粒塊熒光，甚至可見DNA熒光碎片。本試驗通過Hoechst33342對各組細胞核染色，發現LPS組呈現明顯致密濃染(圖2C)，通過Image J軟件對圖片中細胞熒光分析平均光密度達到0.14 pixel，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，PD組、預防組、治療組與對照組相比無統計學意義，提示1 μg·mL-1LPS可造成微血管內皮細胞膜及細胞核損傷，20 μg·mL-1PD可緩解該損傷。

2.2PD對LPS損傷RIMVECs的保護作用

WST可以被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原生成橙黃色的甲臜，可用來反映細胞活性與增殖。結果表明，LPS(0.1、1、10、100 μg·mL-1)可使內皮細胞的甲臜呈現濃度依賴性減少，細胞增殖率分別為97.2%、53.5%、35.3%、15.1%。PD預防組細胞增殖率極顯著高于LPS組 (0.1、1、10、100 μg·mL-1；P<0.01 圖3A)。PD治療組(0.2、2、20、200 μg·mL-1)與1 μg·mL-1LPS相比細胞增殖率均極顯著增高(P<0.01 )，當PD質量濃度高于2 μg·mL-1時細胞增殖率高于100%(圖3B)。

A、B、C、D、E分別為對照組、PD組、LPS組、預防組、治療組HE染色圖片(100×)，F為各組細胞脫落率。與LPS組比較*P<0.05A，B，C，D，E.Figures in the control group，PD group，LPS group，prevention group，treatment group(100×)，respectively.F.The rate of cell loss in each gorup.Compared with the LPS group，*P<0.05圖1　LPS及PD對RIMVECs細胞連接的影響Fig.1　The impact of LPS and PD on the cell junction of RIMVECs

A、B、C、D、E為對照組、PD組、LPS組、預防組、治療組Hoechest染色(200×)；F為采用Image J軟件分析各組平均光密度。與對照組比較**P<0.01A，B，C，D，E.Figures in the control group，PD group，LPS group，prevention group，treatment group (200×)，respectively；F represents the average optical density by Image J.Compared with the control group，**P<0.01圖2　LPS及PD對RIMVECs細胞核的影響Fig.2　The impact of LPS and PD on the nuclei of RIMVECs

當細胞膜破壞后細胞質中活性比較穩定的LDH會釋放出來，因此通過檢測培養液中的LDH釋放量可以定量分析細胞毒性。結果表明，LPS(1、10、100 μg·mL-1)LDH釋放量高于50%，相對應的PD預防組LDH釋放量極顯著降低(P<0.01 圖4A)；PD治療組LDH釋放量極顯著低于1 μg·mL-1LPS刺激時釋放的LDH量(P<0.01 圖4B)。

本試驗發現PD可以預防LPS損傷微血管內皮細胞，同時可以改善LPS損傷內皮細胞后的細胞增殖。

A為不同濃度LPS組、PD預防組細胞增殖情況，預防組與LPS組相比**P<0.01；B為PD治療組細胞增殖情況，與1 μg·mL-1LPS作用時相比**P<0.01A is the cell proliferation of LPS group and prevention group，compared with the LPS group，**P<0.01；B is the cell proliferation of treatment group，compared with the LPS in 1 μg·mL-1**P<0.01圖3　PD對LPS損傷RIMVECs細胞增殖的影響Fig.3　The impact of PD on cell proliferation of LPS-injured RIMVECs

A為LPS組、預防組細胞毒性情況，預防組與LPS組相比*P<0.05，**P<0.01；B為治療組細胞毒性情況，與1 μg·mL-1LPS作用相比**P<0.01A is the LDH release of LPS group and prevention group，compared with the LPS group *P<0.05，**P<0.01；B is the LDH release of treatment group，compared with the LPS in 1 μg·mL-1**P<0.01圖4　PD對LPS損傷RIMVECs LDH釋放量的影響Fig.4　The impact of PD on the LDH release of LPS-injured RIMVECs

2.3跨內皮遷移PMNs殺菌能力評價

與LPS損傷RIMVECs后，PMNs穿越不完整RIMVECs的LPS組相比PD預防組與PD治療組細胞內外細菌量均極顯著降低(P<0.01，表2)。提示LPS對RIMVECs造成損傷，而PD對這種損傷有較好的預防及治療效果，并且可以通過改善RIMVECs以增強PMNs殺菌功能的效果。

表2跨內皮遷移的PMNs殺菌情況

Table 2Transendothelial migration of PMNs sterilization case

分組Group胞內Intracellular胞外Extracelluar對照組46.33±2.52150.66±8.50LPS153.33±8.55185.66±16.04預防組15.33±1.15**26.66±0.57##治療組37.00±6.55**136.33±7.76##

與LPS組胞內比較**P<0.01。與LPS組胞外比較##P<0.01

Compared with the intracellular of LPS group **P<0.01.Compared with the extracelluar of LPS group ##P<0.01

3討論

MVECs是構成血液與組織間屏障的重要組成部分，是功能活躍的內分泌細胞[13]；作為病原在體內擴散造成全身感染的必經之路，暴露在循環介質中的MVECs易被損傷進而引發多種微血管相關疾病[14]。其中RIMVECs是細菌內毒素的靶細胞，是腸黏膜免疫屏障的重要組成部分，是腸道疾病甚至全身疾病發生發展的病理基礎[15]。研究顯示LPS會導致RIMVECs形態變形、黏附分子及細胞因子增加、大量炎癥介質產生、誘導細胞凋亡等病理表現。所以改善MVECs功能，預防毒素損傷MVECs對研究因MVECs受損而導致的疾病具有重要意義。本試驗通過細胞形態染色觀察發現，1 μg·mL-1LPS可造成RIMVECs細胞連接破壞，脫落率可達36.2%。PD預防與治療能夠明顯改善LPS導致的細胞脫落。對于1 μg·mL-1LPS導致的細胞核皺縮濃染，PD可以通過保護RIMVECs的細胞膜進而降低LPS繼續對其細胞核的損傷。

現階段研究證明，MVECs完整性是組織器官發揮其正常生理功能的必要條件，受損MVECs的增殖修復對維持其完整性至關重要，部分中藥可以通過降低MVECs脂質過氧化損傷、調節MVECs活性物質的釋放、提高MVECs存活率抑制其凋亡等方式逆轉或者改變其相應的病理狀態[16]。研究發現丹參麥冬水溶性部位能夠明顯改善損傷后ECs的增殖，增強細胞生長活力進而達到保護ECs的作用[17]。張磊等研究發現黃芪水煎液能夠促進RIMVECs增殖并增強細胞活力，誘導細胞分泌γ-干擾素[18]。PD具有抗菌消炎、燥濕除熱、瀉火止痢等作用，被廣泛應用于治療動物腸道細菌性疾病。韓捷等通過動物試驗觀察PD對體液免疫、細胞因子及自由基的影響發現PD具有抗炎殺菌和修復潰瘍的作用[19]。胡屹屹等通過體內外試驗發現PD可以通過直接抑殺細菌起治療作用且有抗細菌內毒素的作用[20-21]。探討PD對RIMVECs細胞增殖率及細胞毒性的影響，發現預防組細胞增殖率明顯高于LPS組，且其LDH釋放量明顯低于LPS組，提示PD的預防作用可以增強RIMVECs的細胞活力，降低LPS所導致的損傷；治療組較LPS組細胞增殖率顯著增高，LDH釋放量顯著降低，提示PD的治療作用可以改善LPS損傷RIMVECs后的細胞增殖和損傷。

MVECs不僅是LPS的靶細胞，同時也是一種效應細胞，可以通過分泌功能影響炎癥反應。PMNs需要跨越ECs，經歷白細胞募集、黏附、游出、通過阿米巴樣運動穿過血管壁滲到炎癥部位才可以發揮其殺菌功能[22-23]。有研究發現，PMNs溶菌酶的激活與RIMVECs的細胞活性密切相關，PD與LPS作用可以顯著增加跨內皮PMNs溶菌酶濃度[24]。本試驗通過建立PMNs跨RIMVECs模型，檢測PD作用下跨RIMVECs遷移的PMNs殺菌情況。發現PMNs穿越LPS損傷后不完整的RIMVECs殺菌效果顯著降低，PD預防與治療可以明顯改善PMNs的殺菌情況。推測RIMVECs結構的完整性對PMNs的激活和發揮殺菌功能至關重要，而PD能夠有效降低RIMVECs細胞膜及細胞核的損傷，通過保護RIMVECs完整性，使PMNs穿過完好的RIMVECs并且被激活從而發揮其殺菌功能。綜上所述PD不僅有利于細胞增殖，還能夠通過有效保護LPS損傷的RIMVECs從而增強PMNs的殺菌能力。本試驗在細胞水平上對PD藥理作用進行探討，為獸醫臨床使用和研究PD防治細菌性疾病提供一定的試驗數據。

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(編輯白永平)

Pulsatillae Decoction Improves the Bactericidal Capacity of Neutrophils by Protection of Integrity of Microvascular Endothelial Cells

WANG Ming-ming，YANG Shu，DONG Hong*，MU Xiang*

(BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseVeterinaryMedicine，BeijingUniversityofAgriculture，Beijing102206，China)

Abstract:The aims of this paper was to investigate the protective effect of pulsatillae decoction (PD) on endothelial cells injured by lipopolysaccharide (LPS) and to reveal the pharmacological of PD.The cell proliferation and cytotoxicity of the rat microvascular endothelial cells (RIMVECs) were determined by WST-1 ELISA kit and lactate dehydrogenase (LDH) assay.In addition，the RIMVECs damage stimulated by LPS was observed by hematoxylin-eosin (HE) and Hoechst 33342 staining.The transedothlial neutrophils killing was detected by gentamicin protection assay though the build of Transwell.The results showed that LPS (1 μg·mL-1) make the nuclei of RIMVECs shriveled and damage the cell membrane of RIMVECs and lead to cell fall off.The rate of cytotoxicity was 53.2%.The rate of separated cells wass 39.6%.PD(20 μg·mL-1)had the significant proliferative effect for that.LPS induced transendothelial migration of neutrophils can reduce the survival of bacteria in both intracellular and extracellular under the effect of 20 μg·mL-1PD (P<0.01).Results reveal that PD can improve the sterilization function of PMNs by the effective protection of LPS-induced injury of RIMVECs，and might improve the sterilization function of PMNs by protecting the integrity of the RIMVECs to provide a theoretical basis for the dose of clinical treatment of bacterial animal diseases.

Key words:pulsatillae decoction；microvascular endothelial cells；lipopolysaccharide；polymorph nuclear neutrophils

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.025

收稿日期：2015-10-16

基金項目：國家自然基金項目(31272144；31572558)；北京市科委科技計劃(Z121100007412004)；北京市科技新星(Z141105001814041);北京市自然科學基金(6132007)

作者簡介：王明明(1990-)，女，遼寧沈陽人，碩士生，主要從事中獸醫藥及疾病防控方面研究，E-mail：592477872@qq.com *通信作者：穆祥，教授， Tel：010-80799515，E-mail：muxiang1109@sina.com；董虹，副教授，Tel：010-80799480, E-mail：donghong523@163.com

中圖分類號：S853.9

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)04-0836-08