紡織品中雙酚A的表面等離子體共振輔助檢測方法

臧佳鑫， 劉 芳， 魏孟媛， 薛文良,， 鐘成宗

(1. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室， 上海 201620； 2. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200120； 3. 佛山市南海南方技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司， 廣東 佛山 528000)

紡織品中雙酚A的表面等離子體共振輔助檢測方法

臧佳鑫1， 劉 芳2， 魏孟媛2， 薛文良1,3， 鐘成宗3

(1. 東華大學(xué) 紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室， 上海 201620； 2. 上海出入境檢驗檢疫局，上海 200120； 3. 佛山市南海南方技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司， 廣東 佛山 528000)

鑒于雙酚A(BPA)能夠干擾生物的內(nèi)分泌功能，引起各種生殖異常，威脅著嬰幼兒的健康，甚至有致癌的危險等生物危害性，采用表面等離子體共振技術(shù)(SPR)對BPA進行定性定量檢測。從傳感芯片的修飾、BPA-BSA溶液最佳質(zhì)量濃度的確定、不同質(zhì)量濃度BPA的響應(yīng)情況以及紡織品中BPA的萃取等4個方面出發(fā)，探索了SPR技術(shù)檢測紡織品中BPA的實用性。結(jié)果表明，BPA的SPR檢測法具有檢測速度快、對樣品要求低、檢測針對性強、檢測靈敏度高等優(yōu)點，適合檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，可應(yīng)用于紡織品中雙酚A含量的測定。

表面等離子體共振；全反射；生物傳感器；雙酚A；紡織品檢測

在經(jīng)濟全球化各國間貿(mào)易往來頻繁的大環(huán)境下，進出口消費品的檢測備受關(guān)注，在傳統(tǒng)檢測技術(shù)基礎(chǔ)上，新興檢測技術(shù)也在蓬勃發(fā)展，表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)技術(shù)作為新興檢測技術(shù)之一，過去的二十幾年中，在醫(yī)藥方面有了長足的發(fā)展。在其他檢測領(lǐng)域，SPR技術(shù)也在不斷突破，在與其他檢測技術(shù)聯(lián)用方面也取得了一定的成效。

SPR技術(shù)起源于1902年，Wood首次觀測到連續(xù)光譜的偏振光照射金屬光柵時出現(xiàn)的衍射現(xiàn)象，即SPR現(xiàn)象[1]。1941年，F(xiàn)ano解釋了SPR現(xiàn)象。1968年，Otto首先設(shè)計了Otto型棱鏡SPR傳感系統(tǒng)；1971年，Krestchmann對Otto型SPR傳感系統(tǒng)進行了改進[1]。1983年，Liedberg首次采用SPR技術(shù)測試抗原抗體的相互作用[2]。1990年，瑞典Biacore公司生產(chǎn)出世界上第一臺SPR儀[3]，開創(chuàng)了SPR技術(shù)在檢測領(lǐng)域的新篇章。

雙酚A(BPA)是生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的重要原料，也可用于生產(chǎn)各種紡織品染整助劑，如增塑劑、阻燃劑、抗氧化劑等[4]。在紡織生產(chǎn)中，BPA最典型的應(yīng)用是變色功能紡織品上的熱敏變色印花的顯色劑[5]，但是BPA被認(rèn)定是一種環(huán)境激素，能夠干擾多種生物的內(nèi)分泌功能，導(dǎo)致生殖功能下降，引起各種生殖異常，還能使免疫力降低[6]；同時，BPA還具有一定的胚胎毒性和致畸性，威脅胎兒和兒童的健康，有致癌的危險[5]。癌癥和新陳代謝紊亂所導(dǎo)致的肥胖也被認(rèn)為與BPA有關(guān)。歐盟認(rèn)為含雙酚A奶瓶會誘發(fā)性早熟，從2011年3月2日起，禁止生產(chǎn)含BPA的嬰兒奶瓶。本文以雙酚A(BPA)為檢測對象，采用表面等離子體共振技術(shù)，探索紡織品中BPA的SPR檢測方法。

1 SPR方法的工作原理

表面等離子體共振是一種物理化學(xué)現(xiàn)象。當(dāng)一束光線從折射率高的介質(zhì)射入折射率低的介質(zhì)時，若入射角大于臨界角(折射角達到90°時的入射角)，入射光線形成全反射現(xiàn)象[7]。當(dāng)偏振光在玻璃和金屬薄膜的界面上發(fā)生全內(nèi)反射時，會產(chǎn)生漸逝波，從而引發(fā)金屬薄膜中的自由電子產(chǎn)生表面等離子體，在入射角達到某一特定值時，這些表面等離子體就會與漸逝波發(fā)生共振[8]，即SPR現(xiàn)象。

SPR分析儀利用SPR現(xiàn)象，通過在金膜表面修飾與目標(biāo)物能夠特異性結(jié)合的物質(zhì)，當(dāng)目標(biāo)物流過金膜表面時，形成特異性吸附[9]，而使反射光光譜產(chǎn)生變化，用光學(xué)信號的變化反映分子質(zhì)量的變化，從而實現(xiàn)傳感檢測。基于這種原理研究紡織品中危害因子SPR法檢測的可行性。由于紡織品中有毒有害殘留大都是一些小分子物質(zhì)，將對目標(biāo)危害因子有特異性吸附作用的配體(識別因子)固定在芯片表面，當(dāng)目標(biāo)危害因子和識別因子特異性吸附時，引起折射率變化[10]，實現(xiàn)定性定量檢測。

SPR分析儀的核心部件是芯片，由金屬薄膜和玻璃片復(fù)合而成。金屬薄膜最常采用的材料是純金[11]。基于金的化學(xué)惰性較強，在修飾芯片時，要選用一定的方法將配體修飾在金膜表面。

SPR檢測分析方法分為直接法和間接法。直接法是指將抗體修飾在金膜表面，通過目標(biāo)物與抗體結(jié)合引發(fā)共振信號的改變來達到檢測目的。這種方法操作簡單，但僅適用于大分子的檢測，檢出限也比較高。間接法的核心在于提高信號強度，用于小分子的濃度測定或動力學(xué)研究。目前最常用的間接分析方法有信號增強法、競爭結(jié)合法和競爭抑制法。

2 試驗樣品準(zhǔn)備

2.1 儀 器

SPR-Navi表面等離子體共振儀(溫度控制在比室溫略低1～2 ℃)；傳感芯片：裸金芯片，羧甲基葡聚糖組裝(CMD)芯片；超聲波發(fā)生器：工作頻率為40 kHz；立式高壓滅菌器(110 ℃)。

2.2 溶液配方

2.2.1 芯片修飾溶液

11-巰基十一烷酸(11-MUA)的乙醇溶液：將0.109 g的11-MUA溶于100 mL的無水乙醇中制得。

2-嗎啉乙磺酸溶液：將1.95 g 2-嗎啉乙磺酸(MES)溶于100 mL滅菌水中，用氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0。

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽溶液：將0.077 5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)溶于1 mL的MES溶液制得。

N-羥基琥珀酰亞胺溶液：將0.021 7 g N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶于1 mL的MES溶液制得。

三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液： 將0.605 5 g三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶于100 mL滅菌水，用鹽酸(HCl)溶液調(diào)節(jié)pH至6.0。

雙酚A 單克隆抗體(BPA-6C6)溶液：用Tris-HCl溶液將其稀釋至2×10-4μg/mL。

乙醇胺鹽酸鹽溶液：將0.975 4 g乙醇胺鹽酸鹽溶于10 mL滅菌水，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。

2.2.2 測試溶液

磷酸鹽(PBS)緩沖溶液：將8 g 氯化鈉(NaCl)、1.44 g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、0.2 g氯化鉀(KCl)和0.24 g磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶于800 mL純水中，用HCl 溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，再定容至1 L。

雙酚A-牛血清白蛋白(BPA-BSA)溶液：由于不同批次購買的BPA-BSA溶液濃度不一，先用PBS溶液將BPA-BSA溶液稀釋至1×10-4μg/mL備用，根據(jù)試驗要求的質(zhì)量濃度用PBS溶液進行稀釋。

甘氨酸-鹽酸溶液：50 mL 0.2 mol/L的甘氨酸溶液與40 mL 0.2 mol/L的HCl溶液混合，加滅菌水稀釋至200 mL，用HCl 溶液調(diào)節(jié)pH值至2.2。

BPA溶液：1 mg BPA溶于10 mL PBS溶液，配成1×10-4μg/mL備用。根據(jù)試驗要求的質(zhì)量濃度用PBS溶液進行稀釋，并與相應(yīng)質(zhì)量濃度BPA-BSA溶液混合。

3 試驗方案

3.1.1 裸金片修飾方法

1)取一片全新裸金片，用1 mmol/L的11-巰基十一烷酸(MUA)浸沒，4 ℃浸泡過夜；2)將浸泡過夜的芯片用滅菌水清洗，用N2吹干；3)在芯片表面先滴加150 μL的EDC溶液，再滴加150 μL的NHS溶液，于室溫下靜置1 h；4)將芯片水洗吹干，在表面滴加200 μL的BPS-6C6溶液，置于37 ℃恒溫箱中3 h；5)將芯片水洗吹干，在芯片表面滴加200 μL 1 mol/L 的乙醇胺鹽酸鹽溶液，室溫靜置1 h；6)將芯片洗凈吹干備用，或放置于PBS溶液中，4 ℃貯存。

3.1.2 CMD芯片修飾方法

由于CMD芯片表面已經(jīng)修飾上羧甲基葡聚糖，存在Au-S鍵，因此，在芯片修飾時，僅需進行3.1.1中的2)～6)步，且方法相同。

3.2 測試方法

3.2.1 不同質(zhì)量濃度的BPA-BSA溶液測試曲線

“一帶一路”建設(shè)中的廣西保險業(yè)創(chuàng)新路徑 ………………………………………………………………… 吳望春 李春華（5/44）

將修飾過的芯片放入SPR儀，調(diào)節(jié)儀器溫度使之低于室溫1～2 ℃，調(diào)節(jié)流速為30 μL/min，待曲線穩(wěn)定后開始試驗。試驗的緩沖溶液為PBS溶液，再生溶液為pH=2.2的甘氨酸-鹽酸溶液。試驗中，進樣均為注射進樣，具體步驟如下。

1)通入PBS緩沖溶液，待基線趨于穩(wěn)定。

2)進某一質(zhì)量濃度的BPA-BSA溶液，反應(yīng) 6 min左右。

3)進PBS緩沖溶液清洗芯片約8 min。

4)進再生溶液，再生時間應(yīng)控制在6 min內(nèi)，以免破壞芯片的修飾層。

5)進PBS緩沖溶液，洗去再生溶液。

圖1示出質(zhì)量濃度為3×10-4μg/mL的BPA-BSA溶液的響應(yīng)曲線。該質(zhì)量濃度下所對應(yīng)的響應(yīng)值(RU值)變化量為②段與①段的RU值之差；不同質(zhì)量濃度的BPA-BSA溶液的響應(yīng)曲線走勢基本一致，而響應(yīng)強度不同。

圖1 質(zhì)量濃度為3×10-4 μg/mL的 BPA-BSA溶液的響應(yīng)曲線Fig.1 Response curve of 3×10-4 μg/mL BPA-BSA

3.2.2 最優(yōu)的BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度

由于芯片對于不同質(zhì)量濃度的BPA-BSA溶液的響應(yīng)有極限值，當(dāng)質(zhì)量濃度足夠大時，RU值變化量幾乎不再隨質(zhì)量濃度的增加而增大，因此，找到質(zhì)量濃度的臨界值是探索方法的關(guān)鍵，臨界質(zhì)量濃度不僅可保證芯片對BPA-BSA的響應(yīng)達到最明顯，也可有效節(jié)約成本。此臨界質(zhì)量濃度即為最優(yōu)BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度。

采用Fixed Angle模式，在固定角條件下進行試驗，步驟如3.2.1中所介紹，BPA-BSA溶液的質(zhì)量濃度范圍設(shè)定為0～7×10-5μg/mL。圖2示出不同質(zhì)量濃度BPA-BSA溶液所對應(yīng)RU值變化量曲線。

圖2 不同質(zhì)量濃度的BPA-BSA溶液所對應(yīng)的RU值變化量Fig.2 RU value change of BPA-BSA with different concentrations

由圖2可知：當(dāng)BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度低于2×10-5μg/mL時，隨質(zhì)量濃度的升高，RU值變化量的增大比較緩慢；當(dāng)BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度在2×10-5～4×10-5μg/mL時，RU值變化量隨質(zhì)量濃度的升高而迅速增大，有明顯的增長，增幅近倍；而當(dāng)BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度高于4×10-5μg/mL時，盡管質(zhì)量濃度不斷升高，但RU值變化量幾乎不變，保持在一個非常穩(wěn)定的范圍內(nèi)。由此可見，BPA-BSA溶液的最優(yōu)質(zhì)量濃度可確定為4×10-5μg/mL。

3.2.3 不同質(zhì)量濃度的BPA溶液響應(yīng)測試

采用Angular Scan模式，在角范圍條件下進行試驗，此模式下的RU值響應(yīng)要高于Fixed Angle模式，而RU值的變化量也相應(yīng)高于Fixed Angle模式，利于比較芯片對質(zhì)量濃度接近的BPA溶液的響應(yīng)情況。

在BPA-BSA溶液的最優(yōu)質(zhì)量濃度進行試驗，樣品為4×10-5μg/mL的BPA-BSA與x×10-6μg/mL的BPA混合溶液(x=5n，n∈[0，9])，緩沖溶液為PBS溶液，再生溶液為pH=2.2的甘氨酸-鹽酸溶液。

將修飾過的芯片放入SPR儀，調(diào)節(jié)儀器溫度使之低于室溫1～2 ℃，調(diào)節(jié)流速為30 μL/min，待曲線穩(wěn)定后開始試驗。試驗中，進樣均為注射進樣，具體步驟如下。

1)通入PBS緩沖溶液，待基線趨于穩(wěn)定。

2)進4×10-5μg/mL的BPA-BSA與x×10-6μg/mL的BPA混合溶液，反應(yīng)6 min左右。

3)進PBS緩沖溶液清洗芯片約8 min。

4)進再生溶液，再生時間應(yīng)控制在6 min內(nèi)。

5)進PBS緩沖溶液，洗去再生溶液。

圖3示出不同質(zhì)量濃度BPA與4×10-5μg/mL BPA-BSA混合溶液所對應(yīng)RU值變化量。

圖3 不同質(zhì)量濃度的BPA與4×10-5 μg/mL BPA-BSA的 混合溶液所對應(yīng)的RU值變化量Fig.3 Change of RU value of 4×10-5 μg/mL BPA-BSA and BPA with different concentrations

由圖3可知，在BPA-BSA溶液質(zhì)量濃度為4×10-5μg/mL(處于最優(yōu)溶濃度)條件下，剛開始形成4×10-5μg/mL BPA-BSA + 5×10-6μg/mL BPA混合液時，RU值變化量有明顯下降。當(dāng)BPA質(zhì)量濃度在5～3×10-5μg/mL范圍內(nèi)時，RU值變化量與BPA質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系良好，穩(wěn)步下降；RU值變化量與BPA質(zhì)量濃度的線性方程為y=-27.06x+922.67，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 9。而BPA質(zhì)量濃度在3.5×10-5～4.5×10-5μg/mL時，由于接近BPA-BSA質(zhì)量濃度，RU值變化量很低，已接近0。

對于線性情況良好的5×10-6～3×10-5μg/mL段，這一質(zhì)量濃度范圍內(nèi)所對應(yīng)的RU值變化量符合方程y=-27.06x+922.67，其中x代表質(zhì)量濃度，y代表RU值變化量。定量準(zhǔn)確，可用于測定紡織品中的BPA的定量檢測，檢出限為1×10-6μg/mL。

表1示出雙酚A的加標(biāo)回收率。根據(jù)表1可知，在5×10-6～3×10-5μg/mL范圍內(nèi)時，雙酚A的平均加標(biāo)回收率約92%～104%，重現(xiàn)性良好。

表1 雙酚A的加標(biāo)回收率Tab.1 Recovery of bisphenol A

4 與傳統(tǒng)檢測方法的比較

目前，雙酚A的檢測還處于新興階段，應(yīng)用較多的檢測方法還是比較傳統(tǒng)的液相、氣相檢測法。主要有高效液相色譜法[12]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[13]、氣相色譜質(zhì)譜法[14]、衍生化氣相色譜質(zhì)譜法[15]、熒光法[16]等。參考精度較高的氣相色譜質(zhì)譜法，該方法檢出限為1×10-6μg/mL，定量限為4×10-6μg/mL。樣品平均回收率在90%～120%[14]。相比之下，SPR檢測法的檢出限也為1×10-6μg/mL，但回收率范圍更精準(zhǔn)，精度和準(zhǔn)確度較氣相色譜質(zhì)譜法更優(yōu)。

5 紡織品檢測中的實用性

BPA作為紡織品的助劑(增塑劑、阻燃劑等)，應(yīng)用于紡織面料、服裝的生產(chǎn)過程中，BPA溶于甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、醚、苯、醋酸和堿性溶液，微溶于四氯化碳，難溶于水。將BPA的SPR檢測法有效應(yīng)用于紡織品檢測中，必須要解決的問題是如何將紡織品中的BPA盡可能地完全分離出來。考慮到丙酮、醚、苯等的揮發(fā)性、生物毒性等因素，確定用醇作為萃取液，其中，甲醇和乙醇的萃取效果較好。

以選用甲醇作為萃取液為例，萃取方法如下：1)稱取1.0 g待測樣品，剪碎，置于反應(yīng)器中；2)加入10 mL甲醇，確保樣品完全浸沒在甲醇中，超聲萃取30 min；3)將萃取液用聚四氟乙烯微孔濾膜過濾器過濾，經(jīng)水浴氮吹儀濃縮，定容至1 mL，備用；4)采用SPR檢測法檢測BPA的含量，選用甲醇或乙醇對紡織品中的BPA進行萃取，可有效地將BPA分離出來，操作簡單快捷，且試驗成本較低，可應(yīng)用于大批量的紡織品中BPA的檢測。

6 結(jié) 論

本文建立了測定紡織品中BPA的SPR檢測法，該方法檢出限為1×10-6μg/mL，樣品的平均加標(biāo)回收率約為92%～104%，在5×10-6～3×10-5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 9。該方法具有檢測速度快(檢測時間至少可縮短一半以上)，對樣品要求低，可在渾濁樣品中進行檢測，特異性識別度高，一臺儀器便可完成對無機類危害因子和有機類危害因子的檢測等傳統(tǒng)紡織品檢測方法所不能匹敵的優(yōu)點；同時，制樣簡便快捷，適合檢測領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，可應(yīng)用于紡織品中雙酚A含量的測定。

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Detection methods of bisphenol A in textile based on surface plasmon resonance

ZANG Jiaxin1， LIU Fang2， WEI Mengyuan2， XUE Wenliang1,3， ZHONG Chengzong3

(1.KeyLaboratoryofTexileScience&Technology,MinistryofEducation,DonghuaUniversity,Shanghai201620,China； 2.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200120,China； 3.FoshanNanhaiSouthernTechnologyInnovationCenterCo.,Ltd.,Foshan,Guangdong528000,China)

Since Bisphenol A (BPA) can interfere with the endocrine function of the organism, causing all kinds of reproductive abnormalities. At the same time, BPA also has a certain embryonic toxicity and produce teratogenetic and carcinogenic effects, threatening the health of the fetus. It is necessary to test BPA in textiles. BPA is used as the dyeing and finishing auxiliaries in the textiles, and has certain harm to the health of textile users. In the light of the biological hazards of BPA in textiles, it adopts surface plasmon resonance (SPR) to perform the qualitative and quantitative detection of BPA. The practicability of SPR technology in the detection of BPA was explored from four aspects, such as chip modification, determination of the optimum concentration of BPA-BSA solution, the response of BPA with different concentrations and the extraction of BPA in textiles. SPR detection method of BPA has advantages of high detection speed, strong pertinence and high detection sensitivity and low requirements on the sample, is applicable in the detection field, and can be used in the determination of the biphenol A content in textiles.

surface plasmon resonance; total reflection; biological sensor; bisphenol A; textile testing

10.13475/j.fzxb.20150602306

2015-06-10

2015-11-16

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2015IK239)

臧佳鑫(1991—)，女，碩士生。主要研究方向為紡織材料與紡織品設(shè)計。薛文良，通信作者，E-mail:xwl@dhu.edu.cn。

TS 157

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