miR-506對肝癌細胞惡性表型的影響

劉濤，祖彩華，沈中陽

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miR-506對肝癌細胞惡性表型的影響

劉濤1，2，祖彩華3，沈中陽1，2

目的探討微RNA-506（microRNA-506，miR-506）對肝癌細胞活性、增殖和侵襲等惡性表型的調控作用。方法以肝癌細胞系HepG2和QGY-7703為模型，依處理方式不同分別分為細胞常規培養（細胞對照）組、pcDNA3空載體對照組、轉染pcDNA3/pri-506過表達miR-506（過表達miR-506）組、pSIH1空載體對照組及轉染pSIH1/ TuD-506抑制miR-506（抑制miR-506）組。實時定量逆轉錄PCR檢測細胞內miR-506的表達水平。分別用CCK-8實驗、體外集落形成實驗和Transwell侵襲實驗檢測各組細胞的活性、集落形成能力和侵襲能力。結果在肝癌細胞系HepG2和QGY-7703中，與對應的空載體對照組相比，過表達miR-506組的細胞內miR-506表達水平升高，而抑制miR-506組的細胞內miR-506表達水平降低（P＜0.05）；過表達miR-506組細胞活性降低且形成集落的數量和穿過Transwell微孔的細胞數量均減少，而抑制miR-506組細胞活性升高且形成集落的數量和穿過Transwell微孔的細胞數量均明顯增加（P＜0.05）。與細胞對照組相比，pcDNA3空載體對照組和pSIH1空載體對照組均不影響以上各指標（P＞0.05）。結論miR-506抑制肝癌細胞的活性、集落形成能力和侵襲能力等惡性表型，在肝癌細胞中發揮抑癌基因的作用。

微RNAs；肝腫瘤；基因，腫瘤抑制；腫瘤侵潤；細胞活性；miR-506

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，肝癌）是起源于肝細胞的惡性腫瘤，全球每年新發肝癌患者超過500 000例［1］。肝癌具有高增殖活性、高侵襲轉移能力和高復發率特點，術后5年生存率僅為20%～30%［2］。探尋肝癌細胞惡性表型的分子機制，有助于深入理解肝癌的發生機制。微RNA（microRNA，miRNA）是一類長約22個核苷酸的小分子單鏈非編碼RNA家族。在哺乳動物中，miRNA與靶RNA上的miRNA反應元件（miRNA response element，MRE）進行不完全互補配對結合，可促進靶RNA的降解或翻譯抑制［3］。研究顯示，幾乎所有的惡性腫瘤細胞都發生了miRNA表達譜的改變，miRNA的表達失調能夠影響腫瘤細胞的惡性表型［4］。目前，miRNA對肝癌發生發展的影響尚未明確。本研究旨在觀察miRNA-506（miR-506）對肝癌細胞惡性表型的影響。

1材料與方法

1.1材料肝癌細胞系HepG2和QGY-7703（天津賽爾生物技術有限公司），pcDNA3.1（+）質粒（pcDNA3）和pSIH1-H1-puro質粒（pSIH1）為本實驗室保存。引物合成和全基因合成由北京天潤奧科生物科技有限公司完成。限制性內切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ）、T4 DNA連接酶、轉染試劑Lipofectamine 2000 Reagent和mirVana miRNA提取試劑盒（Thermo公司），高糖DMEM和RPMI-1640培養液（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清（Gibco公司），逆轉錄試劑盒Prime-ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa公司），細胞活性檢測試劑cell counting kit-8（CCK-8，Dojindo公司），孔徑8.0 μm Transwell微孔板（Corning公司），Matrigel基質膠（BD公司）。

1.2方法

1.2.1 miR-506過表達質粒pcDNA3/pri-506構建以人類基因組DNA為模板，PCR擴增miR-506前體片段，并克隆插入pcDNA3載體，構建pcDNA3/pri-506質粒，引物序列見表1。

Tab. 1 Sequence of primers used in this study表1　引物序列

1.2.2 miR-506“強誘餌”（tough decoy，TuD）型抑制物表達質粒pSIH1/TuD-506的構建采用全基因合成的方式，在pSIH1-H1-puro質粒中插入TuD-506序列，構建pSIH1/ TuD-506質粒。

1.2.3細胞培養和質粒轉染人肝癌細胞系HepG2和QGY-7703分別在含10%胎牛血清的高糖DMEM和RPMI-1640培養液中培養。質粒轉染細胞按照Lipofectamine 2000試劑說明書進行。依細胞處理方式的不同分為細胞常規培養（細胞對照）組、pcDNA3空載體對照組、轉染pcDNA3/ pri-506過表達miR-506（過表達miR-506）組、pSIH1空載體對照組及轉染pSIH1/TuD-506抑制miR-506（抑制miR-506）組。

1.2.4細胞miRNA提取和miR-506的定量PCR檢測細胞miRNA提取按照mirVana miRNA提取試劑盒說明書進行。以miRNA為模板，逆轉錄生成cDNA，并用SYBR Green法進行定量PCR，檢測miR-506和內參照U6的水平。逆轉錄和定量PCR按照試劑盒說明書進行。miR-506的相對表達水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt = CtmiR-506-CtU6。將細胞對照組的miR-506表達水平設為1，計算其他各組miR-506的相對表達水平。

1.2.5細胞活性檢測將細胞按照每孔5×103接種于96孔板，每組設3個復孔。培養48 h后，每孔細胞加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養2 h后，酶標儀測定各孔在450 nm波長的吸光度值（A450），以各組A450的平均值評估細胞活性。

1.2.6細胞集落形成實驗各組細胞轉染后24 h進行消化并計數，按照每孔100個細胞接種于12孔板。培養8～10 d后，細胞用2%結晶紫染液染色后進行拍照。以集落中細胞數＞50作為集落形成的標準，計數各孔集落數，以各組集落數的平均值評估細胞集落形成能力。

1.2.7 Transwell法檢測細胞侵襲能力將Matrigel基質膠40 μL加至Transwell微孔板的上室。轉染后的細胞在無血清的細胞培養基中，按照每孔細胞數8×10（4HepG2細胞）或4×10（4QGY-7703細胞）、體積200 μL制備細胞懸液，加至Transwell微孔板的上室。下室添加含10%胎牛血清的完全培養液700 μL。37℃培養24 h（HepG2細胞）或12 h（QGY-7703細胞）后，將微孔膜置于固定液（甲醇：冰乙酸=3：1）中固定，2%結晶紫染液染色。顯微鏡下計數5個隨機視野中被染成紫色的陽性細胞個數，以各組陽性細胞數的平均值評估細胞的侵襲能力。

1.3統計學方法采用GraphPad Prism v5.0軟件進行數據分析和圖表制作。計量資料以均數±標準差表示。多組間均數比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1不同處理條件下miR-506在HepG2、QGY-7703中的表達水平比較2種轉染條件下，細胞對照組和pcDNA3、pSIH1空載體對照組miR-506表達水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。在HepG2 和QGY-7703中，過表達miR-506組miR-506表達水平均高于pcDNA3空載體對照；抑制miR-506組miR-506表達水平均低于pSIH1空載體對照組（P＜0.05），見表2。

2.2 miR-506對HepG2、QGY-7703細胞系活性的影響2種轉染條件下，細胞對照組和pcDNA3、pSIH1空載體對照組細胞活性差異均無統計學意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達miR-506組細胞活性均低于pcDNA3空載體對照組，抑制miR-506組細胞活性均高于pSIH1空載體對照組（P＜0.05），見表3。

Tab. 2 The miR-506 expression level in HCC cell lines表2　miR-506在HepG2、QGY-7703中的表達水平（x ±s）

Tab. 3 Effects of miR-506 on cell viability of HCC cells表3　miR-506對肝癌細胞活性的影響

2.3 miR-506對HepG2、QGY-7703細胞集落形成能力的影響2種轉染條件下，細胞對照組和pcDNA3、pSIH1空載體對照組細胞集落數差異均無統計學意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達miR-506組較pcDNA3空載體對照組細胞體外集落形成能力均明顯降低，表現為分散的單個細胞在體外培養時，形成的集落數目減少；抑制miR-506組較pSIH1空載體對照組細胞形成集落的數目均增加，集落形成能力增強（P＜0.05），見圖1、表4。

Fig. 1 Colonies of HepG2 and QGY-7703 cells in five groups（crystal volet staining）圖1　不同處理情況下HepG2、QGY-7703肝癌細胞集落圖（結晶紫染色）

2.4 miR-506對HepG2、QGY-7703細胞系侵襲能力的影響2種轉染條件下，細胞對照組和pcDNA3、pSIH1空載體對照組侵襲細胞數差異均無統計學意義（P＞0.05）。在HepG2和QGY-7703中，過表達miR-506組較pcDNA3空載體對照組細胞的侵襲能力減弱，表現為穿過基質膠并變形通過微孔膜到達Transwell下室的細胞數量減少；抑制miR-506組較pSIH1空載體對照組細胞的侵襲能力增強，表現為穿過Transwell微孔膜的細胞數量明顯增加（P＜0.05），見圖2、表5。

Fig. 2 Invasion of HepG2 and QGY-7703 cells in five groups（crystal violet staining，×100）圖2　不同處理情況下HepG2、QGY-7703細胞侵襲性表現（結晶紫，×100）

3　討論

目前，研究已證實，與正常肝細胞相比，肝癌細胞中miRNA的表達譜可發生明顯改變，發生表達失調的miRNA可影響肝癌的發生、發展［5］。一方面，miRNA在肝癌細胞中可能起到癌基因的作用，促進肝癌細胞的發生發展，例如肝癌中發生上調的miR-25能夠促進肝癌細胞的生長、遷移和侵襲能力［6］。另一方面，一些miRNA在肝癌細胞中具備抑癌基因的活性，如miR-212可抑制肝癌細胞的增殖并誘導凋亡［7］。miR-506在肝癌中的功能作用尚不清楚，本研究通過人工改變HepG2和QGY-7703肝癌細胞內miR-506的水平，對其功能進行探究。

與傳統的化學合成的miRNA反義寡核苷酸（ASO）相比，本研究對miR-506功能的抑制采用miRNA TuD的特殊結構，其具有對靶miRNA的抑制效果穩定且持續時間較長的優勢［8］。

本研究結果顯示，過表達miR-506的細胞經CCK-8試劑染色后，代表細胞活性的A450值減低，而抑制miR-506的細胞染色后A450值升高，表明miR-506能夠抑制肝癌細胞的活性，提示高增殖活性是惡性腫瘤細胞的重要特征。另外，本研究結果顯示，過表達miR-506的肝癌細胞形成的集落數量明顯減少，而抑制miR-506的肝癌細胞形成集落數增加，表明miR-506對肝癌細胞集落形成能力亦具有明顯的抑制作用，提示在體外培養時，單個細胞發生增殖并形成一個單克隆來源的細胞團即細胞集落的能力是腫瘤細胞區別于非腫瘤細胞的重要特征之一。另有研究認為，高轉移活性也是腫瘤細胞惡性程度的指標，且肝癌細胞常具有較高的侵襲和轉移活性，是患者預后不佳的重要原因之一［9］。Transwell通過檢測穿過微孔的細胞數量即可反映細胞的侵襲活性。本研究結果顯示，過表達miR-506的肝癌細胞中，能夠穿過微孔的細胞數明顯減少，而抑制miR-506的肝癌細胞穿過微孔的數量明顯增加，表明miR-506也能夠明顯抑制HepG2和QGY-7703細胞的侵襲能力。

在不同的細胞中或同一細胞的不同狀態下，miRNA可調控的靶基因種類和程度是存在差別的，由此有研究提出了miRNA功能性靶基因的概念［10］。通常情況下，miR-506在多種腫瘤細胞中均具有抑癌基因的活性，但其調控的功能性靶基因可能并不相同。此外，由相同的一個或多個miRNA調控的RNA分子之間能夠以競爭性結合共有miRNA的方式發生相互影響即存在競爭性內源RNA （ceRNA）機制［11］；該作用機制的失調也與惡性腫瘤的發生和發展密切相關［12］。以上兩方面特點使得miRNA介導的基因調控構成一個復雜的網絡，而miRNA是這一網絡的關鍵性分子。本研究則證實，miR-506對肝癌細胞系惡性表型具有抑制作用，表現為對增殖活性、集落形成能力以及侵襲能力的抑制。

綜上，miR-506在肝癌細胞中能發揮抑癌基因的作用，為明確miRNA在肝癌發生發展中的調控作用提供了參考，但具體調控機制有待進一步研究。

（圖1、2見插頁）

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（2016-01-14收稿2016-02-15修回）（本文編輯陸榮展）

Effects of miR-506 on malignance phenotypes of hepatocellular carcinoma cells

LIU Tao1，2，ZU Caihua3，SHEN Zhongyang1，2
1 Key Laboratory for Critical Care Medicine of the Ministry of Health，2 Organ Transplant Center，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300384，China；3 First Central Clinical College，Tianjin Medical University Corresponding Author E-mail：shenzy_2014@163.com

Objective To investigate effects of microRNA-506（miR-506）on malignant phenotypes of hepatocellular carcinoma（HCC）cells，including cellular viability，proliferation and invasion. Methods HCC cell lines HepG2 and QGY-7703 were served as model. Five experimental groups were established in this study，including cell control，pcDNA3 blank vector control，miR-506 over-expression，pSIH1 blank vector control and miR-506 suppression groups. Real-time reverse transcription PCR assay was performed to measure miR-506 level. CCK-8，colony formation and Transwell assays were performed to detect viability，colony formation activity and invasion activity of HCC cell lines，respectively. Effects of miR-506 on these indexes were evaluated. Results In HepG2 and QGY-7703 cell lines，miR-506 level increased in the miR-506 over-expression group（P＜0.01），and its level decreased in the miR-506 suppression group（P＜0.05）compared with the related blank vector control groups. In the miR-506 over-expression group，cellular viability was significantly reduced （P＜0.01），cell colony number decreased，and number of cell penetrating Transwell microporous membrane was also decreased（P＜0.01）. In the miR- 506 suppression group，cellular viability significantly increased（P＜0.01），and both colony number and penetrating cell number increased（P＜0.05）. Also，there were no effects on the above indexes in pcDNA3 and pSIH1 blank vector control groups compared with those of cell control group（P＞0.05）. Conclusion miR-506 plays atumor suppressor role in HCC cells by inhibitingcell viability，colony formation and invasion.

microRNAs；liver neoplasms；genes，tumor suppressor；neoplasm invasiveness；cell viability；miR-506

R735.7

A

10.11958/20160018

國家自然科學基金資助項目（81402322）；天津市企業博士后創新項目擇優資助計劃資助項目（2013）

1天津市第一中心醫院衛生部危重病急救醫學重點實驗室（郵編300384），2器官移植中心；3天津醫科大學一中心臨床學院

劉濤（1981），男，主管技師，博士，主要從事非編碼RNA對腫瘤細胞的調控研究

E-mail：shenzy_2014@163.com